基于SNP 芯片分析安庆六白猪群体遗传结构

时坤鹏，刘 莹，张志勇，吴 睿，丁月云，张晓东，郑先瑞，殷宗俊*

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036；2.望江县现代良种养殖有限公司，安徽安庆 246000）

俗名为“六花猪”的安庆六白猪为肉脂兼用型地方猪种，六白指该品种四肢、额部及尾端为白色，其余部分均为黑色，这也是其区分于其他地方品种猪最显著的一项外表特征。安庆六白猪原产于安徽省安庆市望江县与宿松县，主要分布于望江、太湖、宿松、怀宁等地。安徽省农业委员会2001 年将安庆六白猪列入第一批安徽省畜禽品种保护名录，它也是国家级畜禽遗传资源保护品种之一。由于其瘦肉与肥肉间比例良好，进而具有清晰的大理石纹，安庆六白猪也是优良的生产优质肉猪的理想杂交母本候选之一。安庆六白猪具有适应性强、耐粗饲、抗病性强、繁殖力高、母性好等优点，它不仅是安徽地方特色优良品种之一，也是优质高产猪育种的重要素材。

虽然安庆六白猪具有适应性强、抗病性强、繁殖力高等优点，但同时也因其生长速度慢、瘦肉率低、养殖效益差，以及外来猪种的冲击和养殖群体规模较小等，制约了其产业化开发进程。为了保护我国这一地方优良品种，本研究对部分安庆六白猪进行亲缘关系与遗传多样性分析，避免群体内过度近交造成严重的近交劣势从而导致安庆六白猪的数量继续下降。而对猪群进行亲缘关系分析，最普遍使用的方法就是SNP 分子标记法。

SNP（Single-Nucleotide Polymorphism）即单核苷酸多态性，作为第3 代分子标记的SNP 具有覆盖密度大、较高的遗传稳定性、富有代表性、可自动化分析等优点，不管是动物还是植物领域，进行相关遗传结构分析、分子标记辅助育种、全基因组关联分析时都有所应用。刘晨龙采用高密度SNP芯片对杭猪保种群体遗传多样性、个体所属家系结构及相互间亲缘关系进行了系统分析。任丽群研究宗地花猪经产母猪总产仔数等繁殖性状时，在PRLR 基因外显子10 上发现5 个SNP 位点对这些性状具有显著相关。近些年来伴随SNP 芯片技术不断成熟且该技术花费也在逐渐降低，其愈加成为分析群体遗传结构的性价比最高的一项技术。本研究利用“中芯一号”芯片，对安庆六白猪群体多样性和遗传结构进行分析，旨在为安庆六白猪的保护、开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 供试的来源于望江县现代良种养殖有限公司118 头安庆六白猪，包括公猪18 头，母猪100 头。采集样品均为耳组织，采集后装存于含有500 μL 75%酒精的1.5 mL 离心管中，并置于-20℃冰箱中保存。

1.2 实验方法

1.2.1 安庆六白猪群体DNA 提取与SNP 芯片分型 利用组织基因组DNA 快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取DNA，后通过0.8% 琼脂糖凝胶电泳与Nanodrop 方法对DNA 质量与纯度（D260 nm/D280 nm 比值）进行定量检测。质检合格的样本采用“中芯一号”芯片对其进行基因分型，分型后使用Plink（V1.90）软件对基因型数据进行质控，质控标准如下：去除性染色体上位点并保留常染色体上标记，并且只保留SNP 检出率（call rate）≥90%、个体检出率≥90%、MAF（Minor Allele Frequency）≥0.01、哈迪-温伯格值≥10的位点用于后续分析。

1.2.2 种群亲缘关系鉴定 利用Plink（V1.90）与R 语言软件对118 头安庆六白猪群体质控后的基因型数据遗传结构进行主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）及可视化结果图的制作，了解该群体的聚类情况及遗传多样性。使用Gmatrix（V2）软件对安庆六白猪118 个样本构建G 矩阵，通过R 语言软件绘制矩阵热图后进行亲缘关系分析。

1.2.3 遗传距离分析 本研究利用Plink（V1.90）计算该群体中个体之间的遗传距离并构建状态同源（Identity by State,IBS）矩阵进行IBS 遗传距离分析。采用MEGA10.0 软件与邻接法（Neighbor-Joining，NJ）对SNP 基因型分型数据进行系统发育树图的构建。

1.2.4 ROH 分析 通过Plink（V1.90）对群体中所有个体的ROH（Runs of Homozygosity）进行统计并求出各个样本长纯和片段长度，后与常染色体基因组总长度进行对比得到每个样本基于ROH 的近交系数并计算整个群体的平均近交系数值。分析参数如下：以20 个SNP为一个滑动窗口，每个窗口杂合子个数要≤1。

2 结果

2.1 种群亲缘关系分析

2.1.1 PCA 分析 为了解安庆六白猪群体中个体间亲缘关系，首先利用PCA 分析将个体间的聚类情况展示出来。PCA 结果如图1 所示，通过PCA 分析结果大致了解该群体的遗传结构。由图1 可知，100 个母猪样本基本上属于随机分布，具有较高的遗传多样性，而18 个公畜样本大致形成4 个群落，表明公猪个体间存在较近的亲缘关系，上一代存在近交情况。

图1 118 只安庆六白猪PCA 可视化结果

2.1.2 基于G 矩阵的亲缘关系分析 本研究为了进一步了解个体间亲缘关系情况，进行了G 矩阵分析。安庆六白猪群体G 矩阵分析结果如图2 所示，由于对角线上是每个样本与其本身两者之间的亲缘关系值，亲缘关系值最高所以呈现为黑色，亲缘关系较近的个体会优先聚类到一起，且它们所在的单元格颜色更接近黑色。围绕该G 矩阵分析结果图的对角线，可以看到大致有10个浅灰色区域，这10 个区域证明属于这些区域的样本之间的亲缘关系相对较近。

图2 安庆六白猪G 矩阵分析结果

2.1.3 IBS 遗传距离分析 本研究还将118 个安庆六白猪个体间IBS 遗传距离进行计算，发现该群体中个体间IBS 遗传距离在0.114 5～0.367 2 之间，平均值为0.276 9±0.041 7，证明该群体中个体间遗传距离较大，存在少数个体遗传距离较近。18 头公猪间IBS 遗传距离在0.147 8～0.336 0 之间，平均值为0.273 8±0.042 0，该遗传距离数值表明公猪个体间的遗传距离相对较近（中高等程度的亲缘关系）且有较大差异，之后应对公猪保种配种工作加以重视。

2.2 安庆六白猪基于ROH 的近交系数分析 实验统计了该群体中118 头猪每个个体的ROH 数量与ROH 总长，通过计算得出了所有个体基于ROH 的近交系数。基于ROH 的近交系数可视化结果见图3，该图展示了全部样本的近交系数的分布情况。本实验在118 头安庆六白猪群体中共检测出3 847 个ROH 片段，平均每个个体中约有33 个ROH 片段且个体ROH 总长度约为255.19 Mb。从图中可以发现该群体F的上四分位数在0.15 以下，则说明群体中大多数个体近交系数值都在0.15 以下，该群体近交系数值中位数位于0.1 以下，少数个体近交系数值在0.15 之上，表明小部分个体间存在一定近交情况，亲缘关系较近。

图3 118 只安庆六白猪基于ROH 的近交系数FROH 的分布

2.3 群体家系结构分析 为了直观判断出公猪个体间亲缘关系的远近，本实验通过MEGA10.0 软件绘制公猪聚类分析NJ 树来进行评估。图4 为18 头公猪个体聚类情况，图5 为安庆六白猪群体聚类分析结果。由图4、图5 可以看出18 头公猪个体之间的亲缘关系的远近程度以及家系分属，也能直观了解群体内每个个体所属家系分布情况，本实验以公畜相互间亲缘关系≥0.1 为标准进行聚类。18 头公猪个体各自被划分入家系A、家系B、家系C、家系D、家系E 当中且存在交叉现象，分别含有4、3、8、4、7 个个体。之后依据亲缘关系值≥0.1 划分整个保种群体，家系A 中公猪、母猪个数分别为4、70 头，家系B 中有公猪3 头，母猪67 头，家系C 有8 头公猪，73 头母猪，家系D 的公、母猪个数为4、32 头，家系E 中有7 头公猪，33 头母猪，其中100 头母猪相互间也存在交叉现象，被同时划分入不同家系当中，证明本次实验群体内存在近交情况，与PCA 分析、G 矩阵分析结果保持一致。

图4 18 头公猪聚类分析结果

图5 安庆六白猪群体聚类分析结果

3 讨 论

我国许多地方猪种都存在一个共性问题，就是在各个猪种的系谱记录上都没有严格记录，在对其进行保种工作时大部分猪种系谱资料都是以询问当地农户的方式获取，猪的系谱记录对猪群体保种育种工作是十分重要的。二代或者三代以内猪的亲缘关系通过SNP 标记进行鉴定能够与系谱记录匹配一致。在已报道的对亲缘关系鉴定和遗传多样性分析的研究中，常见的是微卫星标记分析和SNP 标记。但是SNP 标记与微卫星2 种方法对野生红鲑种群的亲缘关系与遗传多样性鉴定中发现，SNP 标记估计群体亲缘关系的准确性要高于微卫星标记。因此本研究采用“中芯一号”（Illumina CAUPorince 50K SNP）芯片对安庆六白猪群体进行亲缘关系分析，个体基因型检出率平均高达98.86%，蓝塘猪与淳安花猪个体平均基因型检出率分别为98.24%和98.49%。研究表明“中芯一号”芯片与我国地方猪种SNP 检测具有极高匹配度，同时也说明了SNP 分型结果的可靠性，可进行下一步分析。

本次研究首先基于芯片基因型数据，之后依次通过PCA、G 矩阵、NJ 聚类、近交系数对该安庆六白猪群体中共118 个个体间的亲缘关系进行了遗传分析，本实验与束婷婷等人在关于2 个瑶鸡群体亲缘关系分析时采用的分析思路一致。PCA 分析以降维思想将千万数据进行删减，仅保留较为重要的几个指标。本研究通过PCA 分析，18 头安庆六白猪公猪被划分成4 个群落，证明公猪群体内存在较近的亲缘关系，而100 头母猪基本上呈现随机分布，表明母猪群体内遗传多样性较高。兰蓉等在研究37 只波尔山羊公羊相互间的亲缘关系情况时利用PCA 分析得到了7 个群落，相比本次研究中18 头安庆六白猪公猪而言，群落数量更为丰富，即使波尔山羊公羊群体个数高于安庆六白猪公猪群体个数，但也可以看出安庆六白猪家系规模的确较小，之后应该注意对安庆六白猪的保种工作加以重视。虽然该PCA 分析得到的4 个群落与最终的NJ 聚类分析所得到的5 个家系分类结果略微有所差异，但是通过对比可以发现2 个分析结果具有一致性。

聚类分析是一种依据个体相互间存在不同程度相似性对群体进行分类的方法，使用该方法可以将群体内不同个体间的亲疏关系以系谱图的方式展现出来。本实验通过NJ 聚类分析法对该群体进行分析后发现18个公畜样本被划分为5 个家系，由于此次NJ 聚类是以公畜相互间分子亲缘关系≥0.1 为标准进行聚类，计算发现存在一些个体与不同家系里面的某些个体间的亲缘关系都≥0.1，所以个体间存在交叉现象导致5 个家系中存在相同公畜。蔡春波等分析马身猪公猪群体时也出现交叉现象，这种交叉现象是由于个体间具有近交情况所造成，地方猪种之后应尽可能去杜绝这种现象。最初PCA 分析的结果也可以看出公畜个体与其他种群中的个体间的距离也比较近，也就进一步证明PCA 分析与NJ 聚类分析2 种分析间结果的一致性。所以当以该家系构建分析结果去进行指导育种时，建议严格按照亲缘关系系数大小进行育种工作，避免因过多近交造成不良后果。

ROH 即长纯和片段广泛存在于所有群体当中，群体遗传历史与ROH 片段的长度及频率存在相关性。本次研究所得近交系数是基于ROH 片段计算出来的，相对基于系谱所得出的近交系数更为可靠，Purfiled 等的研究结果也证实了基于ROH 的近交系数值可信度更高。通过计算群体的近交系数可以进一步了解该群体的近交史。此次研究中安庆六白猪群体的平均近交系数值为0.107。戴丽荷等在利用SNP 标记研究淳安花猪群体遗传多样性时，计算其群体平均近交系数值为0.199，蔡春波等运用SNP 芯片分析马身猪保种群体遗传结构时测得平均近交系数值为0.237，高于本次研究群体。刘彬等研究青裕猪群体遗传结构时测得平均近交系数值为0.075，于国升研究深县猪时近交系数值为0.009 3。虽然本次安庆六白猪群体近交系数值处于中等水平，但这个数值实际来自公母畜的共同作用，从上述PCA 分析以及NJ 聚类分析可以看出，母畜个体间亲缘程度较低，证明18 头公畜个体间近交情况大于总体平均值。即使他们研究群体总量可能大小有所不同，但从总体上来讲本次研究群体的遗传多样性相对较低，之后在进行育种与保种工作时要加以重视。

4 结 论

本项目使用“中芯一号”芯片对118 个安庆六白猪样本进行基因分型，首先利用PCA 分析大致了解该群体的遗传结构，分析结果发现18 头公畜样本被划分成4 个群体；IBS 遗传距离分析以及基于G 矩阵的亲缘关系分析结果展示发现存在一些亲缘关系较近的群体，表明有些个体间存在一定的近交情况；本次实验群体平均近交系数值为0.107，该数值相对较高；NJ 聚类分析将18 头公畜被划分为5 个家系，且家系之间存在重复出现的个体；由上述多个分析结果来看，该群体的遗传多样性相对较低，之后在针对该群体的育种过程中应当科学选配，避免群体内过度近交导致严重的近交劣势。