普氏原羚B型诺维氏梭菌的分离鉴定

简莹娜，王戈平,李秀萍，吴永林，王光华，林伟山，胡勇，何玉邦，马利青

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016;2.青海湖国家级自然保护区管理局，西宁 810001)

普氏原羚(Procapraprzewalskii)是青藏高原地区的特有濒危物种，被列为国家Ⅰ级保护动物[1]。我国从20世纪90年代中期开始，对普氏原羚的生境开展了系统的研究，发现青海湖地区是目前普氏原羚的唯一分布区[2]。

本研究中针对一例死亡普氏原羚进行病原学检测，旨在探讨其发病原因，并提出防治策略。

1 发病情况

2021年10月16日，青海湖南岸普氏原羚保护站发现1只成年普氏原羚不跟群，精神沉郁，行动迟缓，随后卧地不起，最后死亡，由保护站送检至本实验室进行病原诊断。

2 剖检变化

剖检变化主要表现在胸腔积液，心内膜有出血斑，心包积液；肝表面有形状不规则、大小不等的坏死灶，呈黄白色，质脆；脾轻度肿胀，表面有出血点；肺脏气肿，体积增大1倍左右；肾肿大，质地柔软；腹腔有积液；肠淋巴肿大，色黑；空肠臌气，内充满黏性内容物；膀胱充盈；气管环有淤血；喉头稍水肿。

3 病原分离鉴定

3.1 涂片镜检

取病死普氏原羚各组织进行涂片，瑞特氏染色，经镜检发现在肝脏组织中存在单个、散在、两端钝圆的大杆菌，详见图1。

3.2 细菌分离培养

无菌接种病死普氏原羚的心、肝、脾、肺、肾和肠淋等脏器组织至普通营养肉汤、鲜血斜面和厌气肉肝汤(加新鲜生肝)培养基中，经37 ℃培养72 h，在接种肝组织的厌气肉肝汤中，分离得到两端钝圆的大杆菌，并有芽孢存在。

4 分子生物鉴定

参照文献[3]进行B型诺维氏梭菌及溶血梭菌特异性引物合成，经B型诺维氏梭菌及溶血梭菌双重 PCR 检测，结果在肝脏中检测到 B 型诺维氏梭菌特异性片段，详见图 2。

图2 B型诺魏氏梭菌及溶血梭菌双重PCR检测

(M:DL2000；1-6：分别为心、肝、脾、肺、肾以及肠淋组织DNA；N-：阴性对照；P+：溶血梭菌以及B型诺维氏梭菌混合DNA样品)

5 小结

经临床症状，剖检变化，病原菌的分离培养，分子生物学检测，确诊该普氏原羚是感染了B型诺维氏梭菌而引起的死亡。

6 讨论

普氏原羚，别名黄羊、黄滩羊、滩原羚。仅分布于青海湖地区，为青海湖的旗舰物种。随着生态向好，人们保护意识增强，其种群数量由保护初期的300余只增加到目前的2 800余只。普氏原羚的死亡原因较多，其中狼是普氏原羚的主要天敌，其它原因如外伤意外死亡，体内外寄生虫病引发死亡，机体严重缺硒及其它营养物质短缺而死亡，也存在因种群的性别比例、群体类型、群体大小、捕食风险和人类干扰等因素[4]。同时，普氏原羚与家畜牛、羊共享一个草场，使得家养动物跟野生动物之间也存在动物疫病相互传播的可能性。拉毛彭措等[5]报道了在海晏县甘子河地区死亡普氏原羚可能是梭菌病引起的，但并未进行病原学鉴定。

B型诺维氏梭菌广泛存在于土壤中，当羊采食被此菌芽孢污染的饲草料后，以芽孢形式潜藏于肝组织中，当动物肝脏受移行期肝片吸虫的损伤、坏死后，该处的诺维氏梭菌芽胞会大量繁殖，并产生毒素而进入血液循环，引起毒血症，导致死亡。因此，本病的发生经常与肝片吸虫的感染密切相关[6]。随着青海湖水位的不断上涨，救护中心普氏原羚草场大面积被淹没，环青海湖地区，属于地下水位高的沼泽地，有利于肝片吸虫的中间宿主椎实螺的生长与繁殖。

尽管我们可以用撒生石灰或1∶50 000的硫酸铜杀灭肝片吸虫幼虫寄生宿主椎实螺[7]，但偌大的青海湖湿地如何在保护青海湖湿地生态的情况下采取何种方式灭除椎实螺是摆在我们面前的问题。给野生动物注射疫苗和驱虫不切实际，如何保护野生动物免受肝片吸虫和病菌侵扰，又是摆在我们面前的需要探索的课题。

本次从病死普氏原羚的肝脏中检出了B型诺维氏梭菌，根据B型诺维氏梭菌病发病的特点，可基本推断该普氏原羚在救护前曾经在纳滩上生存过，且感染过肝片吸虫；近几年我们在环湖地区的病死羊中检出过B型诺维氏梭菌，也证明了环湖地区存在B型诺维氏梭菌的污染。

随着我们对野生动物病原研究的积累，在今后研究中将开展病原在家养动物和野生动物间的传播机制，其中传播途径、机制以及病原学研究工作的开展，将会为今后控制野生动物以及家养动物相关疾病的防治策略奠定基础。