基于粪便组学的野生哺乳动物肠道微生态研究进展

甄军爱 杨亚昕 朱轶强 任义军 陈玉清*

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏省分子医学生物技术重点实验室，南京，210023；2.江苏省大丰麋鹿国家级自然保护区管理处，大丰，224136)

野生动物泛指生存在天然自由状态下，或者来源于天然自由状态经过短期驯养、但还没有产生进化变异的动物。2021年最新修订的《野生动物保护法》提出要保护、拯救珍贵濒危野生动物，以维护生物多样性和生态平衡[1]。野生动物作为国家珍稀自然资源，可以通过食物链维持生态平衡、维持物质循环(如碳和氮循环)，并促进农业、畜牧业和渔业的发展[2]。然而，由于受到生存环境的不可控性以及自身生理状况的影响，野生动物正面临着不可预知的威胁，例如，进食腐败变质的食物可导致动物患消化系统疾病的概率增加，细菌或病毒感染可引起种群内大范围患病等[3-4]。此外，野生动物也面临着疾病跨物种传播的威胁，如野生动物与植物、家畜、人和不同野生动物之间的跨物种疾病传播，对人类公共健康和野生动物保护都可能构成极大威胁[5]。鉴于野生动物对生态环境健康发展的深远意义，加强珍稀野生动物的基础科学和疾病研究，将对野生动物的种群保护、疾病监控以及野生动物与生态环境和谐共生等提供更科学的管理指导。

肠道微生态由肠道正常菌群及其所生活的环境共同构成，包括肠道微生物群、肠道上皮细胞和黏膜免疫系统，与动物个体健康密切相关[6]。肠道正常菌群是肠道微生态的核心，而肠道上皮细胞和黏膜免疫系统结构及功能则对系统的正常运行影响很大。肠道菌群最显著的特征之一是稳定性，如果失去平衡则会诱发各种肠内外疾病[7]。佛罗里达大学曾发起一项名为“生物技术的生态、进化和保护科学”(BEECS)的项目，旨在通过应用生物技术工具来保护野生动物[8]。大多数野生动物活动范围广泛，人类难以直接接触，因此难以实现如家养动物或动物园动物的样品采集和追踪研究，脱落的毛发、粪便等成为野生动物研究的重要无损伤材料来源[9]。高通量组学作为现代生物技术的重要内容，近年来在人类肠道微生态与疾病的研究中取得了重大进展。基于粪便样本的组学技术已经在野生哺乳动物研究中得到一定应用，显示出组学在生态环境与野生哺乳动物生理及疾病关系、种群发展等研究中的广泛应用前景。本研究对基于粪便的组学技术进行了概括，重点总结了微生物组学和代谢组学在野生哺乳动物研究中的应用，以期能推动组学技术在野生动物研究中的发展，为野生动物保护提供科学的管理方法。

1 基于粪便的组学技术

组学是对组成细胞、组织或生物体的分子进行综合评估，主要包括宏基因组学、转录组学、宏蛋白质组学、代谢组学、脂类组学和微生物组学等。不同组学的研究材料不同，基因组学、蛋白质组学、代谢组学和脂类组学的样本类型相对广泛，血液、组织、细胞、粪便和肠道内容物都可以作为其研究对象。粪便不仅含有肠道微生物和宿主细胞及其内容物(如蛋白质、肽、脂类和代谢物等)，还含有食物、消化产物和摄入的其他物质(如药物和环境无机物等)。因此，粪便是肠道微生态研究的重要样本，并广泛用于宏基因组学和代谢组学等组学分析研究中。

1.1 宏基因组学

除动物细胞基因组外，动物肠道、皮肤和黏膜环境均定居大量微生物(包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等)，其遗传信息的总和称“微生物组”，也称为“宏基因组”(metagenome)[10]。宏基因组主要包括全宏基因组和16S rRNA或18S rRNA扩增子。全宏基因组通过获取微生物群体的全部基因组信息，全面揭示微生物的物种、基因组成和功能。16S rRNA基因约为1 500 bp，有9个可变区(V1—V9区)，不同的可变区序列可用于不同环境中的微生物类群区分，其中27F/338R(V1—V2)、27F/534R(V1—V3)、341F/785R(V3—V4)、515F/806R(V4)、515F/944R(V4—V5)、939F/1378R(V6—V8)和1115F/1492R(V7—V9)等引物常用于粪便样品细菌16S rRNA的扩增[11]。

设计更通用的16S rRNA基因引物集以尽可能覆盖微生物群落的研究正在开展中[12]。18S rRNA为真核生物基因，其高变区为V4和V9，引物对1391F/EukBr和563F/1132R常被用于V4—V5以及V9区的扩增测序。基于18S rRNA高变区的测序分析，为获得肠道真菌和寄生虫组成的信息提供了方法[13]。

1.2 宏蛋白质组学

宏蛋白质组(metaproteomics)是微生物群落的蛋白质组，指在特定时间检测微生物群落全部的蛋白质组成，因此，可以将肠道菌群等微生物群落蛋白的差异表达与菌群功能联系起来，以准确诠释菌群功能[14]。宏蛋白质组学综合应用二维电泳或二维液相色谱的分离技术，结合各种质谱(MS)鉴定技术开展研究，能有效弥补宏基因组学不能鉴定微生物表达产物、不能区分活跃的、休眠的或死亡的微生物群等不足[15]。宏蛋白质组学与宏基因组学结合，能更深入了解肠道微生物群落的功能。粪便、黏液和肠道活检样本可用于胃肠道微生物的宏蛋白质组分析。由于粪便直接接触发炎的肠道，粪便宏蛋白质组常用于评估动物肠道炎症疾病，增加其诊断效用[16]。此外，由于粪便蛋白质可能来自宿主细胞的渗漏、分泌或剥落，或来自微生物群，这些蛋白质/多肽对于某些肠道疾病可能是重要的生物标志物[17-18]。因此，粪便样品的宏蛋白质组学分析可揭示潜在的与宿主动物生理或疾病相关的生物标志物，揭示疾病相关的信号通路以及参与的微生物类群。

1.3 代谢组学

代谢组学(metabolomics)是对研究生物样本中的代谢物进行全面检测和定量测定，以及生物体受到某种刺激时引起代谢物发生的动态变化分析。研究对象通常是相对分子质量小于1 000的小分子物质，包括氨基酸、糖、酮、核苷酸、脂肪酸、有机酸、共生微生物代谢物和外源性小分子(包括药物、食品添加剂和农药)，能提供生物体在取样时生理或代谢状态的重要信息[19]。核磁共振和质谱是代谢组学研究中最常用的分析鉴定技术。质谱通常与色谱技术联用，如GC-MS、LC-MS、CE-MS和SFC-MS等，通过色谱分离提高了质谱检测的灵敏度[20]。代谢组学分析方法包括靶向、非靶向和代谢指纹分析[21]。靶向代谢组学主要对已知代谢物进行多重分析，包括使用标准品对待测物质进行绝对定性定量分析，其不足在于物质的覆盖率有限。非靶向代谢组学是对整个代谢组(代谢物已知或未知)进行系统、全面地分析，尽可能多地采集代谢物信息，因此具有较为广泛的物质覆盖率，但最大的缺点是大多数峰值无法识别，会产生假阳性信号。代谢指纹分析并未鉴定每一种代谢产物，而是将代谢产物的总体特征作为特定代谢状态的独特模式或指纹[22]。鉴于野生动物代谢库资源的研究基础不足，目前非靶向代谢组学在野生动物代谢物研究方面具有明显优势。

2 微生物组学在野生哺乳动物肠道微生态研究中的应用

肠道微生物群是栖息在动物宿主肠道内的微生物群落，由细菌、病毒和真菌等微生物组成，它们在动物的消化道中定居，宿主的生活环境、饮食与肠道微生物群之间相互影响，对动物健康具有重要作用。肠道微生态不仅涉及微生物，还包括微生物的活动区域，从而形成特定的生态位；微生物群形成了一个动态的、互动的微生态系统，能够在时间和规模上发生变化，并整合到真核宿主的宏观生态系统中，对宿主的健康至关重要[23]。大量研究表明，肠道微生物群通过影响宿主发育、消化、行为和免疫系统功能等对宿主健康发挥关键作用。基于粪便的肠道微生物组学分析是野生哺乳动物组学中开展最广泛的研究，在野生哺乳动物肠道微环境与外界环境、饮食和疾病的研究中取得很大进展，对野生动物的生态、管理、保护、繁育和疫病防控等发挥着积极的作用。

2.1 探究野生与圈养哺乳动物肠道菌群的组成与结构差异

肠道微生物菌群对宿主健康非常重要，微生物菌群的组成变化可能会增加动物的感染易感性，降低对环境的适应性。放归自然是野生动物种群恢复和维持濒危动物种群遗传多样性的有效策略，因此，探究圈养和野生动物种群之间肠道微生物菌群的组成和功能变化，对于了解野生动物的健康状况非常重要。国内外基于粪便样品的野生和圈养动物肠道菌群的差异分析已在许多野生哺乳动物中开展，包括大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)[24]、麋鹿(Elaphurusdavidianus)[25]、马麝(Moschuschrysogaster)[26]、林麝(Moschusberezovskii)[27]、梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)[28]、藏野驴(Equuskiang)[29]、狒狒(Papiospp.)[30]、黔金丝猴(Rhinopithecusbrelichi)[31]、川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)[32]、猕猴(Macacamulatta)[33]、黑犀(Dicerosbicornis)[34]、岩羊(Pseudoisnayaur)[35]、华北豹(Pantherapardusjaponensis)[36]、东北虎(Pantheratigrisaltaica)[37]和孟加拉懒猴(Nycticebusbengalensis)等[38]，通过研究可以了解动物肠道微生物菌群的组成差异、获得物种肠道核心微生物菌群和肠道微生物菌群功能差异等大量信息。如Ning等[37]利用16S rRNA高通量测序技术分析圈养和野生东北虎种群肠道菌群的组成和功能变化，揭示出厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)是野生和圈养东北虎肠道细菌中的3个共同核心菌门；饮食习惯不同和环境差异造成了圈养和野生东北虎种群间肠道细菌组成的显著差异，进而导致功能的显著差异；提出野放准备阶段，除考虑东北虎的捕食能力外，还需将肠道微生物菌群的适应作为野外放归的重要准备工作，以实现东北虎对食物和环境的适应性准备，提高野放的成功率。Guo等[39]采用16S rRNA宏基因组测序技术发现野生和圈养大熊猫的粪便微生物菌群差异显著，圈养大熊猫粪便细菌多样性和功能基因多样性显著降低，纤维素降解的功能潜力降低，但淀粉代谢途径丰富，圈养改变了大熊猫的微生物菌群，被放归野外后可能无法适应野生环境。除对肠道细菌的研究外，Hua等[36]通过18S rRNA高通量测序技术比较了人工圈养与野生条件下华北豹肠道真菌菌群的差异，鉴定出野生华北豹特有的真菌门和属，认为圈养与野生华北豹肠道真菌多样性产生的差异可能是圈养和野生条件下食物丰富度不同所致，研究结果为华北豹的迁地保护提供了一定的科学管理依据。通过粪便微生物组学分析可以寻找到圈养与野生动物在肠道微生物菌群上的差异，评价饮食和生存环境等多因素对野生动物肠道微生态的影响，为野生哺乳动物的日常管理和圈养野生哺乳动物的野外放归等提供科学的理论指导。

2.2 分析野生哺乳动物肠道菌群对气候、地域的适应性调节

除了遗传和饮食外，肠道微生态还存在其他潜在环境驱动因素。野生哺乳动物的肠道微生物菌群能对季节和饮食的变化迅速做出反应，以缓冲季节性变化对野生动物能量的影响[40-42]。当前，对野生哺乳动物肠道菌群的研究涉及在不同季节、不同气候特征、不同海拔和不同地域等。如旱季参与纤维发酵和短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)合成的肠道细菌增加，使墨西哥黑吼猴(Alouattapigra)在能量不足时，无需改变活动方式与活动范围也能维持能量平衡[40]；Baniel等[43]研究了降雨量和温度对狮尾狒(Theropithecusgelada)肠道微生物组成的影响，表明狮尾狒肠道微生物组成与降雨量和温度呈共变模式。肠道微生物的变化是由不同季节主要食物的差异所驱动：在多雨时期，肠道菌群主要是专门消化草的纤维素分解/发酵细菌；而在干旱时期，肠道菌群主要是分解植物地下部分淀粉的细菌；在寒冷和干旱时期，与能量、氨基酸和脂质代谢有关的细菌菌群增加，当温度调节和营养应激同时发生时，肠道内的发酵活动受到刺激，有助于狮尾狒维持能量平衡，在东非新的高海拔草原栖息地定居。Zhang等[44]对北京和石首麋鹿保护区麋鹿种群肠道菌群进行分析，发现不同地域麋鹿种群的肠道核心菌群组成相似，但相对丰度和多样性差异显著，认为差异主要源自不同保护区内麋鹿食物的变化，提出在迁地保护过程中应考虑食物变化对麋鹿肠道菌群的影响。生活在青藏高原极端环境中的动物，常受到低压缺氧、低温和高强度紫外线的照射，Ma等[45]发现青藏高原高海拔的藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、藏野驴和藏绵羊(Ovisaries)具有相似的肠道微生物组成，表明它们的肠道微生物群可能适应了高海拔。生活在不同海拔(>3 000 m和<500 m)猕猴种群的肠道菌群在多样性、组成和功能方面也与低海拔种群有显著差异[46]，如高海拔种群以厚壁菌门和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)为主，低海拔种群以拟杆菌门(Bacteroidetes)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)为主，这可能是由宿主饮食、环境温度和氧气压力的差异引起，分化的肠道微生物可能在猕猴对高海拔环境的适应性进化中发挥关键作用。翟子豪等[47]发现峨眉山藏酋猴(Macacathibetanathibetana)和黄山藏酋猴(M.t.huangshanensis)的肠道菌群组成和多样性存在较大差异，且峨眉山藏酋猴肠道存在一定丰度的传染性致病菌，这可能与两地藏酋猴食物组成、生态旅游的管理模式差异密切相关。Gaona等[48]对长鼻蝙蝠(Leptonycterisyerbabuenae)2个地理隔离种群(分别位于墨西哥中部和墨西哥太平洋地区)的粪便微生物组进行分析，发现由于地理隔离和食物资源的差异，2个种群的微生物组发生了显著差异。哺乳动物通过母体产道出生时首次获得肠道微生物，随后在外源食源、水源及周围环境的影响下，肠道微生物多样性逐渐增加，并随着生境等的改变，肠道微生物的组成也发生了相应的变化[49]。因此，野生哺乳动物肠道微生物在一定程度上影响选择条件下的宿主表型，也影响宿主的进化轨迹。

2.3 肠道菌群与野生哺乳动物健康和疾病的研究

近年来，人类肠道菌群改变与疾病的关系[50]以及肠—脑轴[51]、肠—肝轴[52]和肠—肺轴[53]研究取得的进展，为野生哺乳动物相关疾病的研究提供借鉴。当前，包括林麝[54]、长颈鹿(Giraffacamelopardalis)[55]、北平顶猴(Macacaleonina)[56]、川金丝猴[57]、野猪(Susscrofamoupinensis)[58]和食蟹猴(Macacafascicularis)[59]等多种野生哺乳动物肠道微生物组与腹泻关系的研究已有报道。腹泻是一种常见的动物肠道疾病，研究腹泻野生哺乳动物的肠道微生态对认识腹泻病因与发展具有特殊的意义。Li等[54]发现腹泻林麝肠道存在显著不同的肠道菌群结构，且多样性显著降低；鉴定出大肠杆菌(Escherichiacoli)、志贺氏菌(Shigella)和梭杆菌属(Fusobacterium)与腹泻轻重程度相关，认为盲目使用抗生素可能杀死益生菌，加剧微生物群失衡进而加重腹泻，使用益生菌的辅助治疗对林麝腹泻的治疗可能更有益。金洁等[56]采集健康和腹泻北平顶猴的粪便分析肠道菌群的结构以及腹泻过程中肠道菌群的动态变化，显示腹泻个体肠道菌群多样性显著降低，肠道菌群组成与丰度也有显著差异，一些细菌门或属丰度的变化可能是北平顶猴腹泻的重要因素之一。Zhu等[57]发现腹泻川金丝猴的肠道微生物群与健康猴不同，其中拟杆菌属(Bacteroides)丰度减少了45%；腹泻个体肠道微生物结构与丰度的变化伴随着微生物功能的变化，影响全身代谢状态，病原体和吸收不良是导致川金丝猴腹泻的主要原因。

除腹泻外，Krynak等[60]基于16S rRNA分析患有心脏病的西部低地大猩猩(Gorillagorillagorilla)的粪便微生物，发现患病和不患病大猩猩在肠道细菌组成上存在差异。患病个体中拟杆菌门、螺旋体门(Spirochaetes)、变形菌门和厚壁菌门等心脏病重要标志性细菌门的丰度发生变化，初步揭示了大猩猩心脏病与肠道菌群的关系。慢性消耗性疾病(chronic wasting disease，CWD)是一种致命的、具有传染性的神经退化性朊病毒病，影响自由放养和圈养的白尾鹿(Odocoileusvirginianus)、黑尾鹿(Odocoileushemionus)、马鹿(Cerveselaphuselaphus)和驼鹿(Alcesalces)等鹿科(Cervidae)动物的健康，Minich等[61]发现患CWD的白尾鹿肠道微生物组成与健康鹿显著不同，肠道中RF39、LachnospiraceaeUCG-10和Akkermansia显著增加，这些为后续进一步阐明鹿科动物肠—脑轴与CWD发病机制奠定基础。

3 宏蛋白质组学在野生哺乳动物肠道微生态研究中的应用

尽管基于粪便的微生物组学分析可以获得相关个体肠道生态和适应性进化的重要信息，但这些基于基因组的方法仅能预测潜在的功能，而粪便蛋白质组学能准确诠释哺乳动物肠道微生物与动物宿主的直接功能，获得更多哺乳动物行为、生理学和系统发育信息，并可作为生物标志物深入揭示一些疾病的机制。少数家养哺乳动物，如狗和猫的粪便蛋白质组学已有研究报道，Cerquetella等[62]对健康狗和患有食物反应性腹泻狗的粪便蛋白质组比较研究发现，免疫球蛋白J链亚型1为患病狗粪便中特有的蛋白质，推测可能产生于免疫系统的激活或者黏膜损伤。

野生动物粪便蛋白质组学研究起步很晚，Tsutaya等[63]基于粪便蛋白质组学比较不同阶段(婴儿、幼年和成年)的圈养日本猕猴(Macacafuscata)宏蛋白质组，评价个体、食物与粪便蛋白质组的关系，认为粪便蛋白质组学能有效反映日本猕猴哺乳期和断奶期的饮食变化，揭示食物起源并评估肠道内的生理状态。因此，未来需要加大野生哺乳动物粪便蛋白质组学研究，深化肠道微生物组功能和肠道生理的探究，推动野生哺乳动物疾病标志物的发现，促进野生哺乳动物疾病诊断和治疗进展。

4 微生物组-代谢组整合在野生哺乳动物肠道微生态研究中的应用

近年来广泛开展了粪便微生物组与代谢组整合分析(图1)，以深度解析哺乳动物肠道微生态与饮食、环境和疾病间的关系。Gomez等[64]对40只野生大猩猩的粪便肠道微生物组和代谢组进行整合分析，并与采样期间大猩猩的觅食行为数据对比，揭示出野生大猩猩的肠道微生物组成反映了其生存的外部食物环境，即觅食生态，认为大猩猩觅食生态和肠道微生物与食物营养成分之间的共代谢相互作用，可能是野生灵长类动物肠道微生物菌群的重要调节因子。He等[65]整合肠道微生物组-代谢组分析发现，东北虎在经驱虫药芬苯达唑和伊维菌素片治疗后，肠道菌群和代谢表型发生了显著变化，芬苯达唑和伊维菌素片不仅明显改变了东北虎肠道菌群组成，而且改变了粪便代谢表型，一些肠道微生物数量的差异与粪便代谢产物的变化显著相关，表明驱虫片的使用扰乱了东北虎肠道微生物的丰度水平，同时改变了东北虎的代谢平衡。Zhen等[66]整合肠道微生物组-代谢组分析春季不同饮食类型对大丰保护区麋鹿肠道菌群和代谢物的影响，发现同时摄入饲料和天然植物的麋鹿肠道菌群和代谢物显著改变，包括更低的菌群多样性、更多的代谢物变化、增强的适应性代谢途径和代谢物与多种微生物的显著相关性，揭示从饲料到天然植物的过渡期显著影响麋鹿营养和免疫，因此，加强早春食物过渡期的管理非常重要。Hua等[36]发现圈养华北豹的粪便代谢特征与野生华北豹明显不同，检测到圈养华北豹粪便代谢物中的L-蛋氨酸含量显著高于野生个体，推测是华北豹对圈养的一种适应。肠道微生物菌群与粪便代谢物相关分析发现：大多数厚壁菌门的细菌与代谢物呈正相关，大多数拟杆菌门的细菌与代谢物呈负相关，如厚壁菌门与N-乙酰基L-丙氨酸、反式肉桂酸酯、L-蛋氨酸和羟基氢醌具有很强的正相关性；拟杆菌门与脱氧胆酸和胞壁酸呈强负相关，研究结果有助于动物园制定更好的圈养豹管理策略。因此，利用粪便的微生物组学和代谢组学整合的信息，可以更好地理解肠道微生物组和野生动物代谢间的相互作用，阐明环境、饮食、药物和疾病等与野生动物及其肠道菌群活动间的关系，揭示药物治疗、疾病生理、饮食和环境变化等对野生动物肠道微生态与宿主代谢影响的内在机制，并可能寻找到粪便代谢标志物用于野生动物生理与环境的检测。

图1 微生物组和代谢组联合分析流程

5 总结与展望

随着现代生物技术的发展，基于粪便的宏基因组学在野生哺乳动物微生态研究中得到广泛应用，这些研究从肠道微生态角度为野生哺乳动物生理适应、种群历史、环境适应与行为、健康与疾病等动态研究提供了大量信息。然而，基于粪便组学的研究结果仍然存在偏差，因为消化道内的微生物可形成不同的生态位，包括大肠和小肠能形成截然不同的菌群，消化道管腔内和黏膜上的菌群存在差异等[67]，因此，微生物菌群和代谢物并不能完全表征肠道微生物菌群和代谢物[68-69]。另外，代谢组学在野生哺乳动物中的研究报道虽有所增加，在诠释野生动物对食物等外界条件变化时的肠道微生物功能变化与适应性进化方面取得了部分进展，但对于疾病的代谢组学以及疾病标志物筛选的研究尚无报道，关于野生动物宏蛋白质组学的研究则更少。由于粪便样品的易获得性与无损伤性，使得粪便仍然是开展野生动物肠道微生态研究的主要样本，在野生哺乳动物肠道微生态研究中具有特殊的价值。近期，利用组学(微生物组学、代谢组学、金属组学和脂质组学)对野生哺乳动物疾病开展研究已有报道[70]。鉴于不同野生哺乳动物在传染性疾病中的不同作用，以及对珍稀野生哺乳动物疫病研究的重要性，未来利用组学技术深入开展野生哺乳动物生理与疾病研究，将推动对野生动物疾病发生发展的认识，有助于疫病防控和国家珍稀动物资源的持续发展。