不同粒径的聚乙烯微塑料对玉米和黄瓜种子发芽和幼苗生长的影响

刘晓红，刘柳青青，栗敏，刘强，曹东东，郑浩, ，罗先香, *

1.中国海洋大学近海环境污染控制研究所/海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100；2.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266071

微塑料（Microplastics，MPs）指尺寸小于5 mm的塑料纤维、颗粒和碎片等（Thompson et al.，2004；Xu et al.，2020）。MPs广泛存在于农田土壤中。例如，智利大都会地区农田土壤中 MPs丰度范围为600—10400 ind·kg-1（Corradini et al.，2019），韩国中西部地区农田土壤中MPs丰度范围为10—7630 ind·kg-1（Kim et al.，2021）。中国山东寿光农田土壤中MPs丰度范围为310—5698 ind·kg-1（Yu et al.，2021），陕西省19个市县农田土壤中MPs丰度范围为 1430—3410 ind·kg-1（Ding et al.，2020），云南滇池南部柴河流域农田土壤中 MPs丰度高达7100—42960 ind·kg-1（Zhang et al.，2018）。

农业地膜是农田土壤中MPs主要的来源之一，其低的回收率和难降解性导致 MPs在农田土壤中广泛残留（Qi et al.，2020）。2020年，中国农用地膜使用量高达135.7×104t，约占世界总量的70%（靳拓等，2020；中国农村统计年鉴委员会，2021）。农用地膜的主要成分为聚乙烯（Polyethylene，PE）和聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC），其中，PE占比高达60%左右（Ren et al.，2021）。由于塑料的降解周期长并含有多种化学添加剂，MPs已成为土壤生态系统中的持久性有害物质（Ren et al.，2021），对植物生长产生影响。MPs对植物的影响与植物类型、MPs的种类、粒径和浓度有关。例如，在同一植物群落中，添加量0.4%的聚酯纤维微塑料显著促进了拂子茅（Calamagrostisepigeios(L.) Roth）的生长，但绒毛草（HolcuslanatusL.）的生长受到显著抑制（Lozano et al.，2020）。野胡萝卜（DaucuscarotaL.）随着聚醚砜、聚酰胺和聚丙烯纤维微塑料的质量分数从0.1%增加到0.4%，其生物量随之增加，但随着聚酯和聚丙烯薄膜微塑料质量分数的增加其生物量随之降低（Lozano et al.，2021）；粒径 200—250 μm的PE，在0.5%—2%暴露质量分数范围内，小麦（TriticumaestivumL.）地上部鲜重随着微塑料浓度的增加而增加，而在2%—8%的范围内地上部鲜重随着微塑料质量分数的增加而减小（Liu et al.，2021）。一种粒径为 50、500、4800 nm，103—107plastics·mL-1的绿色荧光塑料颗粒显著降低了英菜（LepidiumSativumL.）的发芽率，且随着粒径的增加抑制作用增强（Bosker et al.，2019）；在质量分数为1%的MPs暴露下，片状PE（6.92 mm×6.10 mm）显著降低了小麦根生物量，而颗粒状PE（粒径为0.05—1 mm）对小麦根生物量无显著影响（Qi et al.，2018）。综上所述，MPs的类型、粒径和浓度均会影响植物的生长，但其交互作用对植物的生长的影响并不清楚。

本文选取2种典型农作物主粮玉米（ZeamaysL.）和蔬菜黄瓜（CucumissativusL.）作为供试植物，探究3种粒径的PE在不同浓度下对2种植物种子发芽、幼苗生长和根系形态的影响，探讨了PE粒径、浓度和二者的交互作用对农作物生长的潜在影响，以期为微塑料对农作物的生态评价毒性效应提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用 MPs为广泛用于制备农业地膜原料的聚乙烯微塑料颗粒。3种PE的平均粒径分别为13、58和178 μm，分别命名为PE13、PE58和PE178。供试玉米品种为丹玉86号，黄瓜品种为盛达3号。

实验土壤为山东省招远市（37.43N，120.33E）农田表层土（0—20 cm）。土壤样品经自然风干，剔除石块和植物残渣等杂质，磨碎过2 mm不锈钢筛备用。土壤pH为4.98，总氮含量为0.17%，总碳含量为1.37%。

1.2 微塑料的表征

扫描电镜（Jeol7610F）分析PE颗粒的表面形态结构特征，X射线光电子能谱仪（XPS，Thermo Scientific K-Alpha，美国）测定表面元素含量。

PE颗粒和水按1∶20质量比在40 mL顶空瓶中进行添加剂浸出实验。顶空瓶置于震荡箱 25 ℃黑暗条件以 150 r·min-1震荡 7 d，溶液过 0.45 μm 聚四氟乙烯膜，保存滤液备用（Luo et al.，2019）。pH计法测定滤液pH，TOC分析仪（Elementar TOC-Vcpn，Shimadzu，日本）测定滤液溶解有机碳含量（DOC），电感耦合等离子体质谱仪（NexION 350，PerkinElmer，美国）分析滤液重金属含量。

1.3 种子发芽实验

将颗粒均匀饱满的玉米和黄瓜种子浸泡在 3%H2O2溶液中消毒30 min，使用绢布分离出种子，蒸馏水冲洗 3次后置于饱和 CaSO4溶液中浸泡 12 h后备用。处理好的种子置于直径为90 mm培养皿内以去离子水为基质进行发芽试验。发芽试验中 PE设置5个质量分数梯度，分别为0、0.1%、0.5%、1%和2%，3种粒径PE，每种植物15个处理，每个处理4个重复。每皿10粒种子，每粒种子之间的间距大于1 cm（Yang et al.，2005）。培养皿置于(25±1) ℃的恒温培养箱中，黑暗培养7 d，每天补水保持水分恒定。第7天用直尺测定芽长、根长并计算种子的发芽率RG、发芽势PG和种子活力指数IV（Lian et al.，2020；王波，2018）。

式中：

Nm——日发芽种子数最大时的发芽数；

NG——萌发种子数；

N——供试种子数；

lg——芽长；

lr——根长。

1.4 盆栽实验

以同样的玉米和黄瓜种子进行盆栽实验。每种PE按质量分数0、0.1%、0.5%、1%和2%与80 g土壤充分混合，混合后的土壤放入育苗盒中，加入20 mL蒸馏水活化两天后将浸泡过夜的种子置于育苗盒高度的1/3处，每盆放置3粒种子。每种植物15个处理，每个处理 3个重复。保持土壤水分为田间最大持水量的 60%，每天光照 12 h，光照强度为30000 lx。30 d培养结束后，测量作物的株高，用蒸馏水将农作物根部冲洗干净，滤纸吸干水分，分离地上部和地下部，称质量得到植物鲜质量。利用根系扫描仪（10000XL，Epson Scanning，日本），运用WinRHIZO软件（Prp.2005，Regent，加拿大）分析根系形态。最后，植物在105 ℃下杀青30 min，60 ℃保持恒温72 h，取出烘干后称质量得到植物干质量。PE58和PE178为同一批次试验，PE13为补充批次试验，不同批次试验处理和过程完全一致。

1.5 数据分析

实验结果以平均值±标准偏差表示。使用Excel 2016和Origin 2021进行实验结果的处理分析及图表绘制，使用SPSS 23.0对实验数据进行显著性差异分析（Duncan检验，P=0.05），双因素方差分析（Two-Way ANOVA）探讨PE质量分数、粒径及二者的交互作用对种子发芽、幼苗生长和根系形态的影响，CANOCO 5.0软件分析微塑料特性与种子发芽、幼苗生长、根系形态的关系，所有数据均进行lg(x+1)转换，对种子发芽、幼苗生长、根系形态数据进行去趋势对应分析（DCA），排序轴梯度长度小于3时，适用基于线性的冗余分析方法（RDA），应用Monte Carlo法进行相关性检验。

2 结果

2.1 微塑料的特性

3种粒径的PE表面特征SEM和XPS全程谱如图1所示。PE13粒径范围约为10—30 μm，其表面呈褶皱片层状结构（图1a、d）；PE58的粒径范围约为40—60 μm，多数为近似球形，且表面有凹陷和裂痕（图1b、e）；PE178粒径约为150—200 μm，大多近似球形，有少数呈棒状，其表面存在凹陷和裂痕（图1c、f）。3种PE表面除了含有碳原子外，PE13表面还含有0.72%的氧原子（图1g），PE 58表面含有1.06%氧原子和1.60%的氮原子（图1e），PE178表面含有0.76%的氧原子（图1i）。

图1 PE表面特征扫描电镜图（a—f）和X射线光电子能谱全程谱图（g—i）Figure 1 Scanning electron microscopy (a to f) and X-ray photoelectron spectroscopy (g to i) of surface characteristics of PE

表1为PE浸出液pH、DOC和重金属质量浓度。与空白对照组（CK）相比，PE13浸出液的DOC、重金属Cu和Zn的质量浓度显著升高，PE58浸出液的pH显著降低，DOC和重金属的质量浓度（Cd除外）显著升高，PE178浸出液中Zn的质量浓度显著升高。PE58浸出液中DOC、重金属Pb和Cr质量浓度显著高于PE13和PE178，Cd质量浓度显著高于PE178，这说明相比于另外两种粒径的PE，PE58中含有较多的塑料添加剂。

表1 PE微塑料的物理化学性质Table1 The physicochemical properties of PE microplastics

2.2 微塑料对种子发芽的影响

图2所示为PE对玉米和黄瓜种子发芽和生长的影响。1%的PE13显著降低了玉米种子的发芽率，2%的PE13使其发芽势和发芽率均显著降低；质量分数小于 1%的 PE58均显著降低了玉米种子的发芽势和发芽率，1%和 2%的PE58显著降低了黄瓜种子的发芽势和发芽率，且随质量分数的增加抑制作用增强；PE178对玉米和黄瓜种子的发芽势和发芽率均无显著差异（图2a—d）。Two-Way ANOVA显示，PE的粒径、质量分数及二者的交互作用均显著影响玉米种子的发芽势和发芽率，而仅PE的质量分数对黄瓜种子的发芽率和发芽势有显著影响。与粒径相比，PE的质量分数是影响两种植物种子发芽的最主要因素。

图2 PE对玉米（a、c、e、g）和黄瓜（b、d、f、h）种子萌发的影响Figure 2 Effects of PE on seed germination of maize (a, c, e, g) and cucumber (b, d, f, h)

续图2 PE对玉米（a、c、e、g）和黄瓜（b、d、f、h）种子萌发的影响Continued figure 2 Effects of PE on seed germination of maize (a, c, e, g) and cucumber (b, d, f, h)

0.5%、1%和2%的PE13、2%的PE58、1%和2%的PE178均显著降低了玉米的芽长，且质量分数越大抑制作用越强（图2e）。PE13对黄瓜根的生长显示出低促高抑特征；0.5%、1%和2%的PE58和PE178均显著降低了黄瓜的芽长和根长，且质量分数越大抑制作用越强（图2f）。Two-Way ANOVA显示，PE的质量分数对玉米和黄瓜芽长均有显著影响，但粒径对芽长无显著影响；PE的粒径、质量分数及粒径和质量分数的交互作用均显著影响黄瓜的根长。

种子活力指数反映了种子的活力。2%的 PE13显著抑制了黄瓜种子活力；PE58在所有质量分数下均显著抑制了玉米种子活力，在1%和2%时显著抑制了黄瓜种子活力；PE178在质量分数为0.5%、1%和2%时，显著抑制了玉米和黄瓜的种子活力，且随着质量分数增加，抑制作用增强（图2g、h）。Two-Way ANOVA显示，PE的粒径和质量分数均显著影响玉米和黄瓜种子的活力，但二者的交互作用仅对玉米种子的活力有显著影响。与粒径相比，质量分数是影响2种植物种子活力的最主要因素。

2.3 微塑料对农作物幼苗生长的影响

图 3所示为 PE对玉米和黄瓜幼苗生长的影响。0.1%的PE13显著增加了玉米株高，0.5%和1%的 PE178显著降低了玉米株高（图 3a），0.5%的PE58显著降低了黄瓜株高（图 3b）。Two-Way ANOVA显示，PE的粒径、质量分数及二者的交互作用均显著影响玉米的株高，且PE的粒径效应更显著；PE的质量分数和粒径对黄瓜株高影响不显著。2%的 PE13显著降低了玉米地上部鲜质量，PE178质量分数为1%时显著降低了玉米地下部鲜质量（图3c）。PE58在所有质量分数下均显著降低了黄瓜地上部鲜质量，在0.1%和0.5%时显著降低了黄瓜地下部鲜质量；1%和 2%的 PE178显著降低了黄瓜地上部鲜质量，在质量分数0.5%、1%和2%时显著降低了黄瓜地下部鲜质量（图3d）。Two-Way ANOVA显示，PE的质量分数对玉米地下部鲜质量有显著影响，但没有粒径效应；PE对黄瓜的地下部鲜质量有显著的粒径效应，但PE的质量分数对黄瓜的地下部鲜质量无显著影响。0.1%的PE58 显著降低了黄瓜地上部和地下部干质量，0.5%的 PE58显著降低了黄瓜地下部干质量；PE178在质量分数 1%和 2%时显著降低了黄瓜地上干质量，0.5%和1%时显著降低了黄瓜地下部干质量（图3f）。Two-Way ANOVA显示，PE的粒径、粒径和质量分数的交互作用显著影响黄瓜地下部干质量，且粒径效应更显著。

图3 PE对玉米（a、c、e）和黄瓜（b、d、f）幼苗生长的影响Figure 3 Effects of PE on seedling growth of maize (a, c, e) and cucumber (b, d, f)

2.4 微塑料对农作物根系形态的影响

图4所示为3种粒径的PE对玉米幼苗根系形态的影响及 PE13对黄瓜幼苗根系形态的影响。PE13在质量分数0.1%和0.5%下显著增加了玉米根体积和根表面积。PE58和PE178对玉米的根长、根体积、根表面积和根尖数均无显著影响。PE13在质量分数 2%时显著增加了黄瓜根长、根表面积和根尖数，在质量分数1%时显著增加了黄瓜根尖数。PE对玉米幼苗根系形态的Two-Way ANOVA显示，PE的质量分数对玉米根体积和根表面积有显著影响，PE的粒径对玉米根长、根体积、根表面积和根尖数有显著影响，质量分数和粒径的交互作用对玉米根体积和根尖数有显著影响，PE对玉米的根尖数的粒径效应更显著。

图4 PE对玉米和黄瓜根系形态的影响Figure 4 Effects of PE on root morphology of maize and cucumber

3 讨论

本文利用RDA分析讨论了PE的粒径、质量分数和浸出物对玉米和黄瓜种子发芽、幼苗生长及根系形态的影响（图5）。玉米的RDA排序结果显示，前两个排序轴的特征值为0.471和0.040，玉米生长发育的各项指标与PE特性在第一轴和第二轴的相关系数为0.847和0.636。黄瓜的RDA排序结果显示，前两个排序轴的特征值为0.257和0.067，黄瓜生长发育的各项指标与PE特性在第一轴和第二轴的相关系数为0.838和0.661。Monte Carlo置换检验所有排序轴均达到显著水平（P<0.05），说明排序轴是可靠的。PE特性的筛选采用向前映入法（Forward selection），保留能通过Monte Carlo置换检验的显著因子。其结果显示，与玉米生长发育有显著相关的因子包括PE的粒径、质量分数、浸出液重金属Zn和Cu质量浓度，与黄瓜生长发育有显著相关的因子包括PE的粒径、质量分数、浸出液DOC、重金属Zn和Cu质量浓度。

图5 PE特性与玉米（a）和黄瓜（b）种子发芽、幼苗生长状况的冗余分析Figure 5 Characteristics of PE and redundancy analysis of seed germination and seedling growth of maize (a)and cucumber (b)

玉米的发芽根长、幼苗株高、幼苗根长、根体积和根表面积与PE粒径呈显著负相关，黄瓜的发芽根长、种子活力指数和幼苗干质量与PE粒径呈显著负相关。这说明随着粒径的增加，PE对玉米和黄瓜发芽和生长的负面影响越明显。其可能的原因是随着粒径的增加，PE对植物根系产生更强的机械损伤，诱导植物的氧化应激，抑制了根的发育和植株的生长（Pehlivan，2021；Guo et al.，2022）。玉米的芽长、幼苗的根体积和根表面积与PE的质量分数呈显著负相关；黄瓜的芽长、根长和种子活力指数与PE的质量分数呈显著负相关。这说明随着PE质量分数的增加，PE对玉米和黄瓜发芽和生长的负面影响越明显。其可能的原因是PE质量分数越高，引起植物氧化应激产生的ROS水平越高，会导致更严重的组织和细胞氧化损伤、细胞和基因毒性，从而抑制植物根的发育（Giorgetti et al.，2020）。此外，随PE质量分数增加，积累在植物根系的微塑料量会增加，导致水分和养分吸收阻碍，从而抑制植物种子发芽和幼苗根系生长（Bosker et al.，2019；Sun et al.，2020；Urbina et al.，2020）。

黄瓜的种子发芽势和发芽率、玉米和黄瓜种子的芽长和根长、黄瓜的种子活力指数、玉米幼苗根长、根体积和根表面积与PE浸出液的重金属Zn质量分数呈显著负相关，玉米和黄瓜种子的发芽势和芽长、黄瓜的种子发芽的根长和种子活力指数、玉米幼苗的根长与 PE浸出液的重金属 Cu呈显著负相关。这说明随着浸出液中Cu和Zn质量分数的增加，PE对玉米和黄瓜发芽和生长的负面影响越显著。可能的原因是随着重金属（Zn、Cu）质量分数增加，重金属可能通过增加根细胞膜通透性，降低酶的活性，诱导氧化应激，抑制了种子的萌发和根的生长（Cheng，2003；Esmaeilzadeh et al.，2017；Kovačević et al.，2020；Riyazuddin et al.，2021）。黄瓜的种子的发芽势、芽长、根长和种子活力指数与PE浸出液中的DOC呈显著负相关。DOC质量分数越高表明PE释放的有机添加剂越多，XPS分析结果也显示PE表面含有少量氧和氮，这进一步说明了PE中可能添加了一些含氮和氧元素的阻燃剂、光稳定剂和塑化剂等有机添加剂，微塑料中主要的有机添加剂是塑化剂，包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯、邻苯二甲酸二辛酯等（Wang et al.，2013；Hahladakis et al.，2018；Fauser et al.，2022）。这些有机添加剂可能抑制淀粉酶活性，减少种子萌发养分，诱导植物氧化应激（Gao et al.，2017），从而抑制黄瓜种子萌发和生长。

4 结论

（1）3种粒径 PE对玉米和黄瓜种子发芽和幼苗生长存在显著的毒性效应，且在种子萌发阶段玉米和黄瓜对PE污染更加敏感。PE13对玉米和黄瓜的根系形态影响显著，促进了根的发育。

（2）PE对玉米和黄瓜种子发芽、幼苗生长和根系形态发育均存在不同程度的粒径效应和质量分数效应。随着粒径的增大和质量分数的增加，PE的负面效应更加显著。其中PE的质量分数对两种植物种子的发芽影响更显著，而对幼苗的生长和根系形态，PE的粒径效应更显著。

（3）PE的浸出的重金属和有机添加剂对玉米和黄瓜种子发芽有一定的毒性效应，RDA分析结果显示随着PE浸出物重金属和添加剂质量分数的增加，其毒性效应增强。