eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

阿尔祖古丽·阿卜力孜， 胡美荷，王 楠，刘来珍，古丽妮尕尔·阿力普江，翟少华

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】犬科动物是狂犬病的主要宿主，同时又是囊型包虫病的唯一终末宿主，对犬科动物进行免疫预防是控制这两种疾病传播的关键环节。通过反向遗传学拯救EgM123基因重组狂犬病病毒，可为狂犬病和包虫病二联基因疫苗的研制提供基础，实现从源头控制狂犬病和包虫病的传播。【前人研究进展】狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种动物源性人兽共患病[1]。该病呈全球流行[2]。口服疫苗对犬进行免疫，安全易行，实用方便、省时省力[3-4]。包虫病又叫棘球蚴病，其成虫细粒棘球绦虫寄生于犬科类食肉动物的体内，幼虫细粒棘球蚴寄生于人和多种动物的肝脏和肺脏，导致多脏器内形成细粒棘球蚴包囊[5-6]。将Eg95抗原作为疫苗免疫中间宿主羊取得了很好的进展[7-9]。【本研究切入点】针对终末宿主犬的研究进展较缓慢。犬是作为细粒棘球绦虫的终末宿主，在包虫病的传播中起关键性作用[10]。犬作为狂犬病和包虫病的传播媒介，对犬进行免疫是控制这两种传染病的关键环节。我国边境牧区羊、牛等家畜狂犬病近年来迅速增加[11-14]。毛丽萍等[15]对EgM家族基因在虫体不同发育时期mRNA表达进行分析发现，在成虫阶段，EgM4、EgM9、EgM123的表达较高，尤其是EgM123的表达量是EgM4、EgM9的2.5倍，这表明EgM123基因是细粒棘球绦虫成虫阶段携带的主要基因，参与虫卵成熟阶段的调节或代谢方面有着重要的调控，可作为预防细粒棘球绦虫成虫侵袭的候选基因抗原。【拟解决的关键问题】将细粒棘球绦虫EgM123基因和eGFP基因重组于狂犬病病毒G基因后序列，构建含有eGFP荧光报告基因的融合基因，实现构建的重组质粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP在真核细胞中表达，为通过反向遗传学技术拯救“EgM123基因重组狂犬病病毒”和研制“狂犬病-包虫病二联基因疫苗”提供基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 载体，质粒，菌株及细胞株

pcDNA3.1(-)真核表达载体、pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重组质粒、BHK-21细胞均由兽医病理实验室保存。

1.1.2 主要试剂

大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)；无内毒素质粒提取试剂盒(美国OMEGA公司)；EcoRI、EcoRV限制性核酸内切酶(美国NEB有限公司)；胎牛血清、细胞培养基DMEM、双抗(以色列BI生物科技公司)；Lipo6000TM转染试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；RIPA细胞裂解液、广谱蛋白酶抑制剂、GFP单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；RABV G蛋白单抗、HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的兔抗狗IgG、HRP标记的山羊抗兔子IgG(北京博奥森生物技术有限公司)；犬源细粒棘球绦虫EgM123基因多克隆抗体为新疆畜牧科学院兽医研究所张壮志研究员赠送。

1.2 方 法

1.2.1 pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重组质粒的提取

将已构建并测序鉴定的pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重组质粒吸出1 μL加到大肠杆菌DH5a感受态细胞里轻轻混匀冰上静止30 min，42℃水浴放置90sec，冷却2 min。再向离心管中加入900 μL无菌的LB培养基混匀置于37℃摇床震荡培养45 min，吸取100 μL已转化的感受态细胞均匀涂在LB固体琼脂培养基上，37℃过夜培养。挑取单克隆，摇菌扩繁并按照OMEGA公司无内毒素质粒提取试剂盒要求进行质粒提取，测定质粒浓度，进行PCR，双酶切鉴定。

1.2.2 pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重组质粒的转染

将BHK-21细胞铺板于六孔板用10% FBS的DMEM在37℃、5%CO2培养箱培养18h，待细胞密度达80%时进行转染。取两个无菌的离心管分别加入500 μL不含抗生素和血清的DMEM培养液，其中一管加入10 μg pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP重组质粒，轻轻混匀；另一管加入20 μL Lipo6000TM转染试剂，轻轻混匀，室温静置5 min，将含有重组质粒的培养液加到含Lipo6000TM转染试剂的培养液中，轻轻混匀，室温静置20 min。将混合物按照每孔250 μL的量均匀滴加到六孔板1～4孔内，其余两孔留作对照，十字法晃动混匀，37℃、5% CO2培养箱培养6h后更换培养液，继续培养48 h后在荧光显微镜下观察是否出现绿色荧光。

1.2.3 SDS-PAGE电泳检测G+EgM123+eGFP融合蛋白的表达

将转染48 h后的六孔板弃掉培养液，用PBS洗3次，每孔加入250 μL细胞裂解液，冰上静置30 min，超声破碎3 min，4℃，10 000 g离心10 min，取上清加到新的离心管。加入蛋白上样缓冲液，100℃水煮10 min，4℃离心10 min，-20保存备用。配制8%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔加入20 μL蛋白样品进行电泳，考马斯亮蓝染色液染色2 h，考马斯亮蓝脱色液过夜脱色，观察蛋白表达情况。

1.2.4 Western blotting检测G+EgM123+eGFP融合蛋白的表达

将变性后的G+EgM123+eGFP蛋白样品按每孔20 μL加入聚丙烯酰胺凝胶孔中，其加样顺序为蛋白Marker、G+EgM123+eGFP蛋白，再重复此加样顺序两次后，80V跑40min，120V跑至胶底，取出跑好的凝胶，按照蛋白Marker条带大小切取100 KDa以上的位置，按照纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫依次放好，在恒流300 mA条件下转移到0.45 μm的PVDF膜上，在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h后，再依着彩虹蛋白Marker条带位置用剪刀剪成三段，将PVDF膜分别于RABV-G蛋白单抗(1∶500稀释)、GFP单抗(1∶2000稀释)和细粒棘球绦虫EgM123多抗(1∶500稀释)在4℃过夜孵育。TBST清洗3次，37℃分别孵育HRP标记的山羊抗兔子IgG、HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的兔抗狗IgG(1∶5000稀释)2 h后，TBST清洗3次，曝光观察抗原抗体结合结果。

2 结果与分析

2.1 狂犬病病毒G+EgM123+eGFP重组质粒的鉴定

研究表明，通过pcDNA3.1(-)载体通用引物扩增扩繁后的重组质粒菌液，菌液PCR结果显示，在3 000 bp左右能扩增出目的片段条带，与目的基因片段大小一致。使用限制性核酸内切酶EcoRⅤ/EcoRⅠ对构建的重组质粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP进行双酶切。酶切后，重组质粒在5000 bp和3000 bp左右目的片段和载体成功切成两条带，与目的基因片段大小一致。将菌液PCR和双酶切鉴定的重组质粒送去测序，测序结果正确。pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP真核表达载体构建成功，可用该质粒进行下一步的转染。图1，图2

注：M：10 000 DNA Marker，1：狂犬病病毒G+EgM123+eGFP重组基因3 033 bp

注：M:15 000 DNA Marker，1：重组质粒，2～3：重组质粒酶切结果

2.2 荧光显微镜观察eGFP表达

研究表明，将重组质粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP转染BHK-21细胞48 h后，对照组正常细胞孔没有出现绿色荧光，试验组不同倍数下都能观察到细胞质内呈现的绿色荧光。eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因的融合蛋白G+EgM123+eGFP转染成功并表达正确。图3

A：正常细胞对照 B：48 h观察结果(100×) C：48 h观察结果(200×)

2.3 狂犬病病毒G+EgM123+eGFP融合蛋白表达

研究表明，将转染后48 h的试验孔和对照孔细胞同时进行裂解收取蛋白，经SDS-PAGE蛋白电泳跑胶结果显示，融合蛋白在120 KDa左右处存在明显的蛋白表达条带，而对照组正常细胞蛋白样品没有出现相应大小的蛋白表达条带。为了进一步证明融合蛋白的表达，进行Western blot检测。图4

注：M，预染蛋白Marker；1，G+EgM123+eGFP融合蛋白2，正常BHK-21细胞蛋白；

2.4 Western blot检测G、EgM123、eGFP蛋白表达鉴定

研究表明，G+EgM123+eGFP融合蛋白样品分别与狂犬病病毒G蛋白抗体、细粒棘球绦虫EgM123蛋白抗体和GFP蛋白抗体反应后能够在与考马斯亮蓝染色结果相同位置处检测出特异性条带。3种蛋白分子量大小均为120 KDa左右，与预期蛋白大小相符。这些结果表明构建的真核表达质粒pcDNA3.1-G+EgM123+eGFP能够在真核细胞中成功表达且能够特异性的识别融合蛋白中的鼠源、犬源和兔源抗体。图5

注：M，预染蛋白Marker；1～3，G+EgM123+eGFP融合蛋白样品；

3 讨 论

病毒反向遗传学技术，可以在基因水平上对病毒的基因组进行修饰，可删除毒力相关基因，插入外源抗原基因，并通过病毒的拯救构建可携带外源基因的重组病毒，实现多重免疫目的[16-17]。增强型绿色荧光蛋白eGFP其大小为27 KDa，作为一种报告分子在监测目的基因的表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系分化等方面有着极其广泛的应用。Zheng X[18]在表达eGFP的重组狂犬病病毒研究中发现，携带eGFP基因的重组病毒在病毒传代过程中可持续稳定表达，且对病毒生长特性和复制并未产生影响。试验对后面拯救的重组狂犬病病毒的复制并未产生影响。插入的另外一个外源基因细粒棘球绦虫EgM123主要分布于成熟细粒棘球蚴绦虫的睾丸中，调节精子的产生和受精后表达一种虫卵膜蛋白[19]。为了实现狂犬病病毒G基因和细粒棘球绦虫EgM123基因的共同表达和检测是否表达，构建了融合蛋白G+EgM123+eGFP[20]。经转染并在荧光显微镜下观察发现有绿色荧光出现，通过SDS-PAGE电泳对G+EgM123+eGFP蛋白进行检测，并未发现三种蛋白单独表达，而在融合蛋白120 KDa处出现明显表达的条带，构建的狂犬病病毒G+EgM123+eGFP蛋白融合成功并在细胞内有表达。经Western-blot检测G、EgM123、eGFP蛋白的免疫原性，发现3种蛋白抗原在融合蛋白120KDa处与抗体结合出现了明显的抗原抗体结合条带，构建的融合蛋白对G、EgM123、eGFP蛋白的免疫原性没有影响。

4 结 论

表达出了eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因的融合蛋白，通过SDS-PAGE电泳对表达蛋白进行分析结出了狂犬病病毒G+EgM123+eGFP蛋白是融合蛋白并利用Western blotting 证明了外源蛋白的表达及免疫原性。