UPLC-MS/MS 测定茅苍术中苍术素和苍术苷的含量

张文文，吴琴燕，殷锡峰，孟 娴，倪卫东，梁红芳

（1.镇江市农产品质量检验测试中心，江苏 镇江 212009；2.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400；3.句容市中医院，江苏 句容 212400）

苍术为菊科多年生草本植物，根茎为中药苍术的基原植物之一，具有燥湿健脾，祛风散寒，明目的功效［1］。苍术属植物在我国分布较广，因江苏茅山地区的苍术品质较好，故名为茅苍术［2］。苍术中主要药用成分为苍术素、苍术苷、β-桉叶醇、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ等［3］。2015年版《中国药典》将苍术素规定为苍术的指标性成分，含量不低于0.3%［3］，而在茅苍术中该含量约为0.6%［4］。大量报道表明，苍术苷存在于苍耳子中，含量达到0.1%［5］，苍术苷是否存在于苍术中暂未见报道。目前，对苍术化学成分的检测主要采用HPLC法和GC-MS法进行测定，存在样品基质干扰较大、前处理复杂、检测时间长等问题［3］，本研究拟建立茅苍术中苍术素和苍术苷的UPLC-MS/MS检测方法，以期为茅苍术的质量评价提供科学依据。

1 实验材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

超高效液相色谱：Agilent 1290；质谱检测器：ABsciex 4500；电子天平：XP105DR 型，赛多利斯科学仪器有限公司；超纯水系统：AWL-020I-P，艾科浦仪器有限公司；超声波清洗器：KQ-250E型，昆山禾创超声仪器有限公司；医用离心机：H2050R 型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

甲醇和乙腈（色谱纯，美国默克公司）；乙酸铵（≥98%，德国CNW 公司）；苍术素、苍术苷标准样品购买于成都曼思特生物科技有限公司，纯度＞98%。质谱用水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 标准溶液配置

母液配置：分别称取苍术素和苍术苷1 mg，苍术素加入1 mL丙酮溶解，苍术苷加入1 mL甲醇溶解，分别配置成1 mg/mL的母液，-20 ℃保存后，备用。

标准溶液的配置：按照梯度稀释法，分别配置苍术素浓度为100、50、25、12.5、6.125 mg/L的单一标准品溶液，苍术苷浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L的单一标准品溶液。

1.3 仪器工作条件

色谱柱：Agilent C 18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸混合水溶液（A）和0.1%甲酸混合乙腈溶液（B），洗脱梯度：0～1 min，40%A；1～5 min，40%～10%A；5～9 min，10%A；9.00～9.10 min，10%～40%A；9.10～12.00 min，40%A。进样体积为1 µL；流速为0.2 mL/min；柱温为40 ℃。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI）；离子源加热温度（TEM）450 ℃；离子源电压（IS）为-4500 V；碰撞气（CAD）为medium；气帘气（CUR）为10；雾化气（GS1）为45 ℃；辅助气（GS2）为45℃。检测方式为多反应检测模式（MRM），监测离子及相应参数见表1所示。

表1 MRM监测模式条件下质谱参数

1.4 样品前处理

茅苍术（购买于句容茅山农户）通过试验粉碎机（FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司）对苍术进行粗粉碎至过40目筛网后备用。

提取溶剂试验：准确称取1 g苍术粉末，分别采用水、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醚、乙酸乙酯和甲醇7种提取剂40 mL，室温条件下超声（250 W，频率35 kHz）提取30 min，离心取上清待测。

提取时间试验：准确称取1 g苍术粉末，选择合适的提取溶剂40 mL，在室温条件下，分别超声提取5、15、30、45、60 min，离心取上清待测。

提取甲醇含量试验：准确称取1 g苍术粉末，分别取40 mL浓度为0、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇，室温条件下超声提取30 min，离心取上清待测。

提取液固比试验：取40 mL甲醇和一定量的苍术粉，在液固比分别为5、10、20、40、80和120 mL/g时，室温条件下超声提取30 min，离心取上清待测。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱条件优化 依据每个化合物响应值的差别，把苍术素和苍术苷分别配置为25.0和0.5 mg/L的标准品溶液，进行质谱条件优化，2种化合物均在正离子扫描模式下，苍术素获得了准分子离子［M+H］+，苍术苷获得的脱钾离子［M-K+H］+，响应明显较高，以此作为母离子，进行子离子扫描分析，图1、图2为2种化合物的二级扫描质谱图，选择响应值高的离子为二级特征离子，该离子碎片与文献报道结果一致［6-7］。根据特征离子，对去簇电压、碰撞能量等参数进行优化，使得离子对的信号达到最高，优化后的质谱条件如表1所示。

图1 苍术苷二级扫描质谱图

图2 苍术素二级扫描质谱图

2.1.2 色谱条件优化 根据2种化合物的理化性质，选用C18色谱柱，选择5 mol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）为水相，乙腈为有机相，经过反复实验确定1.2所述洗脱程序，可以在8 min内获得良好的分离效果和适当的出峰时间。苍术素在4.5 min左右出峰，苍术苷在1.5 min左右出峰，且基质中杂峰较多，此梯度可以实现苍术素与杂质较好的分离（图3、图4）。苍术苷分子量较大、干扰小，样品中含量低。

图3 标样中苍术素色谱图

图4 标样中苍术苷色谱图

2.2 线性关系、检出限和定量限

根据1.2标准溶液配制浓度数据，获得方法的线性关系、检出限和定量限如表2所示。

表2 线性关系、检出限和定量限

2.3 样品前处理条件优化

2.3.1 提取溶剂的影响 乙腈［8］、丙酮［8］、异丙醇［9］、乙醚［9］、乙酸乙酯［10］、甲醇［11］和三氯甲烷［8］是非极性物质的主要提取剂，苍术素为非极性物质，苍术苷为极性物质，采用水、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和三氯甲烷的同时提取苍术素和苍术苷（图5），发现采用甲醇提取，苍术素和苍术苷提取量均高于其他提取剂，分别为0.908 mg/g和7.010 μg/g。

图5 不同提取溶剂对苍术素和苍术苷含量的影响

2.3.2 提取时间的影响 由图6可知，提取时间对苍术素有一定的影响，随着时间的延长，提取量升高，30 min后不再变化；提取时间对苍术苷无明显影响，30 min为最佳提取时间。

图6 提取时间对苍术素和苍术苷含量的影响

2.3.3 甲醇浓度的影响 据文献报道，适量的水对原料具有溶胀作用，可以促进有效成分的溶出。由图7可知，在对仓术的提取过程中，甲醇浓度的不同，对苍术苷的影响较大，浓度越高，提取量越高；而对苍术素的影响不明显，因此，水的溶胀作用并未有效促进苍术苷和苍术素的提取量，最佳提取溶剂为100%浓度甲醇。

图7 甲醇浓度对苍术素和苍术苷含量的影响

2.3.4 提取液固比的影响 液固比的影响如图8所示，由图8可知，液固比在80 mL/g时，苍术素和苍术苷提取量达到最佳值，继续增加液固比，含量变化不明显。

图8 液固比对苍术素和苍术苷含量的影响

2.4 回收率和标准偏差

取40 mL甲醇，加入0.5 g苍术粉，并加入一定量的苍术素和苍术苷标品，使苍术中分别含有1.0、0.5、0.2 mg/g的苍术素标样和2.5、10.0和20.0 μg/g的苍术苷标样，每个浓度重复4次，计算该方法的回收率和相对标准偏差（RSD），结果表明，3个浓度加标水平下，苍术素和苍术苷的回收率分别为77.9%～95.0%和72.5%～106.6%，相对标准偏差为5.3%～9.5%和9.5%～12.6%，均符合检测要求（表3）。

表3 样品加标回收率和相对标准偏差

3 结论

建立了使用LC-MS/MS快速测定茅苍术中苍术素和苍术苷的方法，通过优化质谱和色谱参数，2种化合物均具有较高的离子化效应的离子对和最佳检测条件。采用超声提取，对提取溶剂、提取时间、甲醇浓度和固液比4个提取条件进行优化，发现以甲醇为提取剂，在液固比为80 mL/g，超声提取30 min，苍术素和苍术苷的提取量均达到了较高水平，分别约为1.6 mg/g和18 μg/g。该方法前处理简单、分析快速、定性定量准确、检测限低，可以满足茅苍术中对苍术素和苍术苷的检测要求。