佛手瓜SePLR基因克隆和生物学分析

赵 倩， 谭国飞， 钟秀来， 陈志峰， 孟平红*

(1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院， 山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省园艺研究所， 贵州 贵阳 550006； 3.遵义师范学院 生物与农业科技学院, 贵州 遵义 563006)

0 引言

【研究意义】佛手瓜[Sechiumedule(Jacq.) Swartz.]又名捧瓜，为葫芦科多年生草本攀援植物[1-2]。佛手瓜、嫩叶、茎和块根均可食用，是一种药食同源蔬菜[3-4]。佛手瓜原产于墨西哥，19世纪传入中国后在贵州、云南、福建、海南、四川和重庆等地区种植较多[5-6]。佛手瓜生长快、产量高，瓜平均产量为4 000～6 000 kg/667m2。佛手瓜含有丰富的营养物质，是名副其实的无公害保健蔬菜，对治疗胸闷胀气、疏肝止咳、消化不良等均有一定作用。现代医学研究发现，佛手瓜果实中含有生物碱、皂甙、甾醇、饱和脂肪酸、黄酮和鞣质[7]，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血压、降血糖、保护肝肾等功效[8-10]。佛手瓜作为保健蔬菜，鉴定和分离其营养物质合成基因对佛手瓜营养物质的开发利用和品种改良具有重要意义。【前人研究进展】木脂素是一类苯丙烷类化合物，常以二聚体形式存在于植物中[11]。目前已发现的木脂素有200多种，且不同植物中木脂素的类型和作用不同[12]。木脂素是植物中天然存在的保健药用成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血压及预防神经系统疾病的发生等药理作用[13]。植物体受到外界环境胁迫，特别是受到病原微生物侵害后，导致植物体内的木脂素大量合成，用于增强植物的防御能力[14]。松脂醇-落叶松脂酚还原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductase, PLR)是木脂素生物合成的关键酶之一。该酶在大多数植物中可连续催化两步还原反应[15]，但在拟南芥中仅催化一步还原反应[16]。已有研究表明，木脂素的生物合成是从苯丙氨酸开始，苯丙氨酸在一系列酶的催化下生成松柏醇，2个松柏醇通过漆酶或过氧化物酶在聚合蛋白的帮助下偶联形成松脂醇(Pinoresinol)[17]。松脂醇在PLR的催化下生成落叶松脂素，落叶松脂素进一步在PLR的催化下生成开环异落叶松脂素[18]。【研究切入点】目前，PLR基因在五味子、菘蓝和其他各科植物中均有报道，佛手瓜中未见研究报道。【拟解决的关键问题】选用表面青色、无刺的佛手瓜材料为研究对象，从转录组数据库中检索获得1条SePLR基因，设计引物并克隆该基因，以及对佛手瓜SePLR基因展开分子进化分析及在不同组织中的表达分析，为佛手瓜营养物质的开发利用及佛手瓜的种质创新提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及栽培条件 选用种植在贵州省园艺研究所试验基地的青色、无刺佛手瓜为试验材料。2021年7月25日，采集同株瓜藤上的花、须、嫩叶、叶柄、嫩茎及不同发育阶段的瓜(授粉5 d、10 d、15 d)，每个样品设置3次生物学重复。样品采集过程中快速用灭菌的手术刀将不同发育阶段的瓜切成薄片，用锡箔纸包好后快速放入液氮中速冻，并保存于-80℃冰箱中，用于RNA的提取及LC-MS非靶向代谢组学分析。

1.1.2 试剂 RNA Simple Total RNA Kit试剂盒购于北京天根生物技术有限公司，反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit (Perfect Real-Time) 、PCR高保真聚合酶Ex Taq、pMD19-T克隆载体、SYBR Premix Ex Taq试剂盒购于大连宝信生物工程有限公司，Axygen胶回收试剂盒购于南京赛泓瑞生物公司，氨苄青霉素(Amp)购于北京索莱宝科技有限公司，甲醇、L-2-氯苯丙氨酸、乙腈、甲酸、异丙醇购于天津市富宇精细化工有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 Implen超微量分光光度计采购于上海书俊仪器设备有限公司，冷冻组织研磨仪GD-16Plus采购于深圳市新锐科技发展有限公司，高速冷冻离心机VL-200R采购于湖南迈克尔实验仪器有限公司，PCR仪和Bio-Rad PrimePCR仪采购于上海伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 佛手瓜RNA的提取及cDNA的合成 取保存于-80℃冰箱的佛手瓜样品，将其分别置于灭菌后的研钵中，使用液氮将采集的佛手瓜样品研磨成细小粉末，准确称取0.1 g于2 mL的离心管中，用于佛手瓜总RNA的提取，剩余样品继续保存于-80℃超低温冰箱中备用。

佛手瓜总RNA的提取按照RNA Simple Total RNA Kit试剂盒说明书进行。提取的佛手瓜总RNA分别使用胶浓度为1.2%琼脂糖凝胶检测RNA的完整性，以及使用微量分光光度计Nanodrop ND-100 (Nanodrop Technology Inc., DE,USA)检测RNA的浓度。随后，使用反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit (Perfect Real-Time)将提取的佛手瓜总RNA反转录为cDNA。反转录的cDNA用灭菌的ddH2O稀释15倍后，保存于-20℃冰箱，用于目的基因的克隆及荧光定量PCR分析。

1.2.2 佛手瓜SePLR基因的克隆与鉴定 从贵州省园艺研究所测定并建立的佛手瓜转录组数据库中，通过检索获得1条佛手瓜SePLR基因，命名为SePLR1。以该基因序列作为参考，设计1对克隆引物(SePLR1-KL-F和SePLR1-KL-R，表1)，克隆长度为927 bp。克隆使用PCR高保真聚合酶ExTaq进行目的基因的克隆。克隆体系：2×Taq Master Mix 15 μL，正、反引物各1.5 μL、稀释的cDNA模板2 μL，用灭菌的ddH2O加至30 μL。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54℃复性30 s，72℃延伸70 s，34个循环；72℃延伸5 min；最后12℃保存。PCR产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行目的片段的分离，将鉴定正确的条带在紫外灯下用干净的手术刀快速切下，之后按照Axygen胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收。回收的PCR产物按照克隆载体说明书将目的基因连接到pMD19-T克隆载体上，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经100 mg/L氨苄青霉素(Amp)筛选后挑取单菌落进行菌液PCR鉴定。将菌液检测正确的单菌落，委托生物公司进行目的片段的测序。

表1 佛手瓜SePLR基因克隆的引物

1.2.3 序列生物信息学分析 运用Primer Premier 6.0设计荧光引物。利用BioXM推测SePLR1编码的氨基酸序列、蛋白质相对分子质量和等电点。使用MEGA 5.2对从佛手瓜中克隆得到的SePLR1基因的蛋白序列与其余物种中的PLR蛋白序列(表2)进行系统进化树的构建。SePLR1蛋白质亲水性和疏水性分析使用DNAMAN。利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析SePLR1蛋白结构域，使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行SePLR蛋白质的保守结构域预测。

表2 不同物种的PLR1蛋白信息

1.2.4 荧光定量PCR分析 根据佛手瓜SePLR1基因的克隆测序结果，设计1对荧光定量引物(SePLR1-YG-F 和SePLR1-YG-R，表1)。利用该对荧光引物研究SePLR1基因在佛手瓜不同组织中的表达情况。按照SYBR Premix Ex Taq 试剂盒的说明书进行荧光定量分析。荧光定量PCR反应体系：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，稀释的模板cDNA 2 μL，正、反引物各0.5 μL，灭菌的ddH2O 7 μL。以佛手瓜ACTIN为内参基因(SeACTIN-F和SeACTIN-R, 表1)，与目的基因一起扩增。每个样品设置3次重复。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，54℃退火30 s，65℃延伸10 s，40个循环；最后8℃保存。相对定量表达使用参照基因ΔCT法，表达差异等于2-ΔCT，ΔCT=CT目的基因-CTACTIN，然后根据试验结果绘图。

1.2.5 LC-MS非靶向代谢组学 取保存于-80℃的佛手瓜样品，准确称取0.05 g置于2 mL离心管，加入1颗直径为6 mm的研磨珠，加入400 μL提取液(V甲醇︰V水=4︰1)，含0.02 mg/mL的内标L-2-氯苯丙氨酸)，使用冷冻组织研磨仪在10℃、50 Hz的条件下研磨6 min，随后低温超声(5℃、40 KHz)提取30 min，-20℃静置30 min，4℃、14 000 r/min离心15 min，移取上清液至带内插管的进样小瓶中，用于进一步LC-MS非靶向代谢组分析。

LC-MS 分析仪器平台为AB SCIEX公司的超高效液相色谱串联飞行时间质谱UHPLC-Triple TOF系统。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm；Waters，Milford，USA)；流动相A为95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸)；流速为0.40 mL/min，进样量为10 μL，柱温为40℃。质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。

原始数据导入代谢组学处理软件ProgenesisQI(WatersCorporation，Milford，USA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐等，最终得到含保留时间、质荷比和峰强度等信息的数据矩阵。其后采用该软件进行特征峰搜库鉴定，将MS和MS/MS质谱信息与代谢数据库进行匹配，MS质量误差设置为小于10 mg/L，同时根据二级质谱匹配得分鉴定代谢物。

2 结果与分析

2.1 佛手瓜SePLR1基因的克隆与结构特性

以佛手瓜cDNA为模板，根据设计的克隆引物进行PCR扩增获得目的基因片段(图1)，条带清晰，可用于下一步分析。经测序，佛手瓜SePLR1基因序列全长927 bp(GenBank: MZ707298)，编码308 个氨基酸(图2)。其蛋白质的相对分子质量和等电点分别为34.24 kDa和4.66。该基因编码的蛋白质中酸性氨基酸占氨基酸总数的21.04%，碱性氨基酸占11.33%。SePLR1蛋白质含有5个保守结构域(表3)，含有1个NAD(P)结合位点和1个脯氨酸(Lysine)活性结构域，属于NADB_Rossmann superfamily超家族。SePLR1蛋白的二级结构中α螺旋(Alpha helix)占18.51%，β折叠(Pleated sheet)占25.32%，无规则卷曲(Random coil)占56.17%。该蛋白质具有疏水和亲水两重特性(图3)。三级结构模型预测显示，SePLR1蛋白具有20个α螺旋和一些无规则卷曲(图4)。通过对SePLR1蛋白的二级结构和三级结构的预测可知，SePLR1蛋白中无规则卷曲所占的比重较大。

注：M为标准分子量。

注：*表示终止密码子。

表3 SePLR1蛋白的保守结构域

图3 佛手瓜SePLR1氨基酸序列疏、亲水性

图4 佛手瓜SePLR1蛋白的三级结构模型

2.2 佛手瓜SePLR进化树

由图5可见，佛手瓜和其余28种植物及4种微生物的PLR氨基酸序列构建的系统进化树，植物和微生物在进化上存在一定差异，分成二个大分枝。SePLR1基因编码的氨基酸序列在同一个科的植物中进化更为保守，聚集在同一个分枝，如葫芦科、茄科、杨柳科、豆科、芸香科、十字花科、菊科、棕榈科；但同属于蔷薇科桃、甜樱桃与苹果并不在同一分枝。葫芦科和芸香科及蔷薇科的苹果进化关系较近；佛手瓜与同属于葫芦科的冬瓜、甜瓜、黄瓜亲缘关系较近，但与同一个科的其他物种在进化上却存在一定距离。

图5 佛手瓜SePLR氨基酸序列的系统进化树

2.3 佛手瓜SePLR基因在不同组织中的表达

由图6可见，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测，SePLR1在佛手瓜不同组织中的表达特异性不同，SePLR在小瓜中表达量最高，在茎中表达量最低。佛手瓜不同部位SePLR基因的表达表现为小瓜>花>中瓜>须=叶>老瓜>大瓜>叶柄>茎。

注：不同小写字母表示差异达显著水平。

2.4 佛手瓜木脂素种类

通过LC-MS代谢组学方法从佛手瓜中鉴定出2种木脂素(表4)，分别是Sesaminol glucosyl-(1->2)-glucoside[芝麻氨基葡萄糖基-(1->2)-葡萄糖苷]和(8S,8′S)-Secoisolariciresinol 9-xyloside[(8S，8′S)-癸二烯酸树脂醇9-木糖苷]。

表4 佛手瓜木脂素种类

3 讨论

木脂素存在于植物的各部位[19]，PLR是木脂素生物合成的关键酶和限速酶之一，且PLR在不同植物间及同一物种内不同发育阶段和不同组织中的表达存在显著性差异[20-21]。菘蓝是木脂素丰富的药用植物，XIAO等[22]从菘蓝中克隆得到PLR基因，对菘蓝木脂素生物合成途径中的关键酶基因PLR的研究发现，PLR基因在菘蓝根中表达量最高、花中表达量最低。通过qRT-PCR检测发现，佛手瓜的各部位均有SePLR基因表达，小瓜中SePLR1基因表达量最高，茎中表达量最低，且在瓜发育的4个时期SePLR1基因的表达也存在显著差异。佛手瓜嫩和老均影响其口感[23]。大瓜是佛手瓜果实的最佳食用期，但在瓜发育期间SePLR1基因在大瓜中的表达量最低。研究发现，不同植物的PLR在进化上相对保守，表明PLR的氨基酸序列、基因序列在不同植物中的一致性均较高。通过同源比较发现，葫芦科和芸香科、蔷薇科的亲缘关系较近；且佛手瓜与冬瓜、甜瓜、黄瓜中的SePLR1蛋白的进化关系最近。

HEMMATI等[24]发现，亚麻中有多达5个PLR基因，但目前只研究了2个，命名为LuPLR1和LuPLR2。研究表明，PLR1基因在亚麻种子发育的初期表达量增加；LuPLR1和LuPLR2基因在亚麻根和种子中均有表达，但仅在亚麻的茎和叶检测到LuPLR2基因的表达。NAKATSUBO等[16]拟南芥中克隆2个PLR基因，将其命名为AtPrR1和AtPrR2；FUJITA等[25]从北美乔柏中克隆得到3个PLR基因(TpPLR1、TpPLR2.2、TpPLR3)。该研究中，对建立的佛手瓜数据库中表明，可能佛手瓜中SePLR含有3个及以上。同时，该研究利用LC-MS代谢组分析，初步鉴定出2种木脂素，这2种木脂素成分未找到相关研究报道，特有性和药用保健功能，以及准确的分子结构需要进一步研究。下一步将对佛手瓜的转录组数据库进行检索，进一步确定佛手瓜中合成木脂素的关键酶基因SePLR的数量和木脂素成分，探究佛手瓜在受到不同环境胁迫后SePLR基因的表达情况和木脂素含量之间的变化关系。

4 结论

选用贵州栽培面积最大的青色、无刺佛手瓜作为材料，克隆木脂素合成关键酶基因SePLR，并对SePLR基因进行初步生物信息学分析，该基因全长927 bp，编码氨基酸为308个，酸性氨基酸比碱性氨基酸多。该蛋白质的相对分子质量和等电点分别为34.24 KDa和4.66。SePLR1蛋白含有NAD(P)和脯氨酸(Lysine)的结合位点，且具有疏水和亲水性。SePLR1蛋白的主要二级结构元件是β-折叠和无规卷曲。佛手瓜SePLR1与同属于葫芦科的冬瓜、甜瓜、黄瓜的亲缘关系较近，且葫芦科和芸香科进化关系较近。SePLR1在小瓜中表达量最高，其次是花，在茎中表达量最低。此外，通过LC-MS代谢组学从佛手瓜中鉴定出Sesaminol glucosyl-(1->2)-glucoside[芝麻氨基葡萄糖基-(1->2)-葡萄糖苷]和(8S,8′S)-Secoisolariciresinol 9-xyloside[(8S，8′S)-癸二烯酸树脂醇9-木糖苷]2种木脂素成分，为佛手瓜木脂素成分的开发利用及佛手瓜新种质的创新提供理论参考。