外源过氧化氢处理对采后荔枝褐变及活性氧代谢的影响

潘家丽，覃子倚，李 静，Khoo Hock Eng，董新红

（桂林理工大学化学与生物工程学院/广西电磁化学功能物质重点实验室，广西桂林 541004）

0 引言

【研究意义】荔枝（Sonn）是无患子科（Aspindaceae）荔枝属（）植物，其味道鲜美，含有多种营养成分并具有多种生理功能，深受消费者喜爱（伍志权等，2017；齐文娥等，2019）。但荔枝是一种典型的非跃变型水果（Zhang et al.，2018），在采后贮藏阶段易被病原菌侵染，且采后生理代谢活动依旧旺盛，使果实内部的水分和营养物质流失（李华彬等，2017），进而导致果实品质劣变，不利于荔枝的采后贮存和运输。因此，积极开发实用、安全的采后保鲜技术，对荔枝果实贮藏品质、营养价值和商业价值的保持，以及货架期延长均具有重要意义。【前人研究进展】目前大多采用涂膜、化学药品处理、气调贮藏和低温贮藏等方法对采后荔枝进行保鲜处理（疏秀林等，2012；张长勇等，2013；Bhushan et al.，2015）。Lin等（2011）研究发现经1%壳聚糖涂膜处理能降低荔枝果实的呼吸作用，减少水分流失，延长货架期。Liang等（2012）研究表明经60 g/L焦亚硫酸钠浸泡能有效缓解采后荔枝的褐变反应，减少腐烂，从而延长果实的贮藏寿命。于茂兰等（2014）研究表明在高氧气调包装下能延缓荔枝褐变相关酶活性，但不利于维生素C（Vc）含量的保持。周沫霖等（2016）研究发现低温驯化结合低温贮藏可使采后荔枝保持鲜红色泽，维持较高的感官和口感品质。自由基衰老学说认为果蔬衰老的过程是活性氧（ROS）代谢与积累的过程（孙丽娜，2008；郭欣等，2020a）。从龙眼（Lin et al.，2014）、皇冠梨（王庆国等，2020）的研究中可知，过量的ROS累积会导致膜脂过氧化，破坏细胞膜结构，促进细胞衰老。因此，ROS水平是影响采后果实贮藏品质的重要因素。过氧化氢（HO）是一种强氧化剂，无色无毒，对环境友好，在食品行业中的应用越来越广泛（石晶等，2009；Bauzá et al.，2014）。外源HO处理果实，对果实是一种氧化胁迫，这种氧化胁迫可能会提高果实对其他胁迫，如冷害、高温、水分胁迫时的抗氧化防护能力（刘扬，2009）。赵习姮等（2010）研究发现HO处理可诱导提高樱桃番茄和芒果的抗氧化酶活性，增加抗冷性，减轻冷藏期间受到的冷害问题；刘佩等（2017）研究表明采后黄冠梨经HO预处理，可抑制多酚氧化酶（PPO）活性和酚类物质消耗，从而减少果皮褐变的发生。【本研究切入点】虽然目前已有外源HO处理采后水果进行保鲜的研究，但尚未见关于外源HO对荔枝采后褐变及ROS代谢的研究。【拟解决的关键问题】通过研究不同浓度HO处理对荔枝各生理指标变化的影响，探讨外源HO对荔枝采后褐变及ROS代谢的影响，为荔枝采后保鲜提供途径，以期提高果实的贮藏品质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

妃子笑荔枝购自桂林市五里店果蔬批发市场（当天采摘无处理），HO溶液（纯度99%）购自上海源叶生物科技有限公司。主要仪器设备：FSJA03E1小熊粉碎机（小熊电器股份有限公司）、722PC可见光分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）、TU-1950紫外分光光度计（济南思奇医疗设备有限公司）、PHS-3E电导率仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）和NR60CP色差仪（深圳市三恩时科技有限公司）。

1.2 试验方法

取大小相近、色泽均一、无病虫害、成熟度相近的荔枝，于常温下分别用1、5和10 mmol/L的HO溶液浸泡3 min，以清水处理为对照（CK），自然晾干荔枝表皮水分后，用保鲜袋分装于4 ℃下贮藏，分别于贮藏后0、3、6、9和12 d取样，进行失重率、褐变指数和细胞膜透性等生理指标测定；使用液氮速冻粉碎荔枝果皮样品，用于丙二醛（MDA）含量、内源HO含量、超氧阴离子（O）产生速率、PPO活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指标的测定。所有试验重复3次，结果取平均值。

1.3 测定指标及方法

失重率参照王磊明（2018）的方法测定；褐变指数参照蒋侬辉等（2019）的方法测定；MDA含量参照Liu等（2018）的方法测定；细胞膜透性参照李静等（2016）的方法，将切取的果皮圆片于25 ℃浸泡3 h，采用电导率仪（PHS-3E）测定；内源HO含量和O产生速率参照曹建康等（2007）的方法测定，提取上清液的离心时间均为30 min；PPO活性参照白国荣（2019）的方法测定；SOD活性参照王照宇（2017）的方法测定，测定管置于4000 lx光照下反应20 min。

1.4 统计分析

采用Excel 2010进行数据处理，使用SPSS 25.0进行显著性分析，以Origin 8.5绘图。

2 结果与分析

2.1 外源H2O2处理对采后荔枝果实失重率的影响

由图1可知，随着贮藏时间的推移，采后荔枝果实失重率不断升高。贮藏6 d后，5 mmol/L外源HO处理的荔枝果实失重率低于其他处理和CK，但差异不显著（>0.05，下同），1 mmol/L外源HO处理的失重率与CK差异小，而10 mmol/L外源HO处理的荔枝果实失重率高于其他处理和CK，差异也不显著。贮藏至第12 d时，5 mmol/L外源HO处理荔枝果实的失重率最低，较CK降低14.29%，10 mmol/L外源HO处理荔枝果实的失重率最高，较5 mmol/L处理增加26.56%，说明5 mmol/L外源HO处理能较好地降低采后荔枝果实的失重率，减少荔枝贮藏过程中水分与营养物质的损失，而10 mmol/L外源HO处理增加荔枝水分流失，加速果实品质下降。

2.2 外源H2O2处理对采后荔枝果皮褐变指数的影响

如图2所示，在贮藏期间荔枝果皮的褐变指数不断增大。贮藏3~9 d时，1和5 mmol/L外源HO处理能有效抑制果皮褐变，10 mmol/L外源HO处理的果皮褐变指数一直高于CK和其他处理。贮藏至第12 d时，1和5 mmol/L外源HO处理的荔枝果皮褐变指数较CK分别降低4.11%和24.66%，而10 mmol/L外源HO处理的果皮褐变指数最高，较5 mmol/L处理增加60.00%，加剧荔枝果皮的褐变。结果表明，低浓度的外源HO处理能抑制荔枝果皮褐变，其中5 mmol/L外源HO处理效果最佳，高浓度的外源HO处理则会加剧果皮褐变，加快荔枝衰老。

2.3 外源H2O2处理对采后荔枝果皮MDA含量的影响

由图3可知，在0~12 d贮藏期间，CK与外源HO处理组的采后荔枝果皮MDA含量均表现出上升—下降—上升的变化趋势。贮藏至第3 d时，1和5 mmol/L外源HO处理的荔枝果皮MDA含量显著低于CK和10 mmol/L外源HO处理（<0.05，下同）；贮藏至第6 d时，各外源HO处理的果皮MDA含量均升高，其中5 mmol/L外源HO处理的MDA含量最低，且显著低于其他处理和CK，较10 mmol/L处理降低35.08%；贮藏6~9 d时，果皮MDA含量下降，各处理和CK之间差异显著；贮藏至第12 d时，5 mmol/L外源HO处理抑制MDA含量积累的效果最佳，较CK降低44.72%，而10 mmol/L外源HO处理的果皮MDA含量显著高于CK和其他处理，其中较5 mmol/L处理增加88.73%。说明低浓度的外源HO处理能抑制荔枝果皮MDA 的产生和积累，高浓度（10 mmol/L）的外源HO则提高果皮中MDA含量。

2.4 外源H2O2处理对采后荔枝果皮细胞膜透性的影响

细胞膜透性可通过相对电导率高低来反映，相对电导率越高，细胞膜透性越大，反之亦然。如图4所示，随着贮藏时间的延长，不同处理采后荔枝果皮的相对电导率逐渐升高。1 mmol/L外源HO处理的相对电导率在贮藏3~6 d时显著低于CK和10 mmol/L外源HO处理，贮藏9~12 d时则差异不显著；5 mmol/L外源HO处理的相对电导率在贮藏3~12 d时显著低于CK；而10 mmol/L外源HO处理的相对电导率在贮藏3~12 d期间始终保持最高，但与CK无显著差异。进一步说明低浓度的外源HO处理能改善采后荔枝果皮细胞膜透性，其中5 mmol/L外源HO处理效果最佳，过高浓度则加剧细胞膜结构的破环程度。

2.5 外源H2O2处理对采后荔枝果皮内源H2O2含量的影响

由图5可知，采后荔枝果皮在整个贮藏期间，CK与外源HO处理组之间的内源HO含量变化虽有所差别，但均呈上升趋势。贮藏至第3 d时，各处理和CK的荔枝果皮内源HO含量差异不显著；贮藏至第6 d时，10 mmol/L外源HO处理的果皮内源HO含量最高，显著高于1和5 mmol/L外源HO处理；贮藏至第9 d时，10 mmol/L外源HO处理的果皮内源HO含量保持最高，1 mmol/L外源HO处理的果皮内源HO含量最低，且显著低于10 mmol/L处理；贮藏至第12 d时，5 mmol/L外源HO处理的果皮内源HO含量显著低于CK和其他处理，其中较CK降低13.75%，而10 mmol/L外源HO处理的果皮内源HO含量显著高于CK和其他处理，较5 mmol/L处理提高31.36%。表明5 mmol/L外源HO处理能有效抑制采后荔枝果皮内源HO的产生，减少ROS积累，10 mmol/L外源HO处理则加速ROS累积。

2.6 外源H2O2处理对采后荔枝果皮O2-产生速率的影响

从图6可看出，在贮藏期间，5 mmol/L外源HO处理的采后荔枝果皮O产生速率一直下降，且显著低于CK和其他处理（贮藏3 d与CK无显著差异除外），贮藏至第12 d时，5 mmol/L外源HO处理较CK降低22.63%；而其他处理在0~9 d贮藏期间，O产生速率均有一个先下降后上升的限降，在第9 d达最大值后又逐步下降，但贮藏末期（第12 d时）仍显著高于5 mmol/L处理，CK、1 mmol/L和10 mmol/L外源HO处理的O产生速率较5 mmol/L处理分别增加29.24%、23.89%和29.65%。从O产生速率可看出，使用适宜浓度外源HO处理采后荔枝可抑制ROS产生，减少ROS应激导致的膜脂过氧化，延缓果实衰老进度。

2.7 外源H2O2处理对采后荔枝果皮PPO活性的影响

PPO是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，可催化酚类物质氧化成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成褐色或黑色的聚合物从而导致组织褐变。由图7可知，贮藏期间采后荔枝果皮的PPO活性总体呈先上升后下降的变化趋势，PPO活性峰值时间均出现在贮藏第3 d，说明PPO在荔枝贮藏前期较活跃。贮藏3~6 d，荔枝果皮PPO 活性开始下降，1 和5 mmol/L外源HO处理的果皮PPO活性明显低于CK和10 mmol/L处理；贮藏6~9 d，荔枝果皮的PPO活性逐渐上升；9~12 d时，各处理和CK的果皮PPO活性均下降，贮藏至第12 d时，5 mmol/L处理的PPO活性显著低于其他处理，较CK降低38.72%，而10 mmol/L HO处理的PPO活性显著高于1和5 mmol/L处理，分别提高61.12%和136.97%，说明低浓度外源HO处理可抑制荔枝果皮的PPO活性，减少荔枝果皮的褐色物质生成，而高浓度外源HO处理加剧采后荔枝褐变速度，加速荔枝衰老。

2.8 外源H2O2处理对采后荔枝果皮SOD活性的影响

SOD是生物体内的一种抗氧化酶，可作为反映荔枝品质的重要指标之一。从图8可看出，经外源HO处理的荔枝果皮SOD活性在贮藏前期（0~3 d）逐渐升高，且在第3 d时达峰值，5 mmol/L外源HO处理的荔枝果皮SOD活性最高，显著高于其他处理和CK，较CK提高31.39%；贮藏3~6 d，各处理的SOD活性逐渐下降，贮藏至第6 d时，各处理和CK之间差异不显著；贮藏6~9 d，各处理的SOD活性均下降，5 mmol/L外源HO处理的荔枝果皮SOD活性保持最高；在贮藏末期（第12 d），5 mmol/L处理的SOD活性较CK显著提高31.41%，而其他处理之间差异不显著，说明5 mmol/L外源HO处理可提高采后荔枝果皮的SOD活性，从而维持果实较高的抗氧化水平。

3 讨论

果实采后品质下降与ROS氧化密切相关，当ROS处于正常水平时无害（Czarnocka and karpiński，2018）。但发生环境胁迫时，荔枝果皮O和HO的积累量就会增加，细胞膜透性增大，若过量的ROS无法及时消除，就会损坏生物大分子，促进细胞衰老，加速荔枝果实的腐败。细胞内存在ROS清除体系，而SOD作为清除体系中重要保护酶之一，其对氧自由基具有抑制作用，可分解O和HO等活性氧化物，延缓植物衰老（张绿萍等，2012）。本研究结果表明，在4 ℃贮藏条件下3种浓度的外源HO处理均不同程度提高采后荔枝果皮的SOD活性，但经5 mmol/L外源HO处理的果皮SOD活性显著提高，相比CK，在贮藏至第12 d时，SOD活性提高34.41%，与此同时内源HO含量减少13.75%，O产生速率减少22.63%，1 mmol/L处理的内源HO含量和O产生速率虽有减少，但效果不如5 mmol/L外源HO处理显著，而10 mmol/L处理的内源HO显著提高，说明5 mmol/L外源HO处理能有效增强荔枝果皮的自由基清除能力，抑制活性氧化物的产生。该研究结果与Liu等（2010）使用外源HO处理黄瓜、Li等（2011）使用外源HO处理小麦幼苗的研究结果相似，在适宜浓度外源HO的作用下，SOD活性与内源HO含量和O产生速率呈负相关，可提高植物的抗氧化水平，增强植物对其他胁迫的耐受力。

MDA是荔枝果实成熟软化进程中膜脂过氧化的重要产物之一，可作为判断荔枝果实是否进入衰老阶段的指标之一。而细胞膜透性的大小反映出果皮细胞抗逆性的强弱，是评价果实品质的一个重要指标（郭欣等，2020b；千春录等，2020）。本研究发现，在采后荔枝的贮藏期间，低浓度的外源HO处理可降低荔枝果皮的MDA含量和相对电导率，而经5 mmol/L外源HO处理的MDA含量和相对电导率降低效果最显著，说明经5 mmol/L外源HO处理可减轻采后荔枝的膜脂过氧化作用，降低果皮电导率，改善细胞膜透性，减轻细胞膜的损害程度，与Chumyam等（2019）利用外源HO处理鲜切番石榴的研究结果一致。

PPO活性直接影响果皮褐变程度，果实组织中的酚类物质会经PPO的催化氧化形成醌类物，然后进一步聚合生成褐色物质，引起果皮褐变（马岩松等，2000）。本研究结果表明，经1和5 mmol/L外源HO处理采后荔枝果皮的PPO活性和褐变指数均低于CK，而10 mmol/L处理均高于CK。贮藏至第12 d时，5 mmol/L处理的PPO活性较CK降低38.72%，褐变指数降低24.66%，有效减缓了荔枝果皮的褐变速率，保持荔枝良好的外观和营养品质。该研究结果与Chen 等（2015）使用HO处理甜瓜、林毅雄等（2016）利用外源HO处理采后龙眼的研究结果相似，原因可能是适宜浓度的外源HO处理有效维持了三磷酸腺苷（ATP）含量，保持线粒体的完整性，抑制ROS代谢及膜脂过氧化的进行，从而延缓果皮褐变。果蔬品质的变化可通过失重率的变化反映出来，失重率上升越快说明果蔬品质越差。本研究发现，贮藏至第12 d时，CK和1、5、10 mmol/L外源HO处理的失重率较第9 d分别提高24.69%、21.52%、21.13%和32.39%，说明低浓度的外源HO处理能缓解荔枝失重率的上升速度，减少荔枝水分流失，高浓度的外源HO处理则加快失重率的上升，降低采后荔枝的品质。研究结果对于HO在果蔬保鲜贮藏领域的应用具有重要意义，生产中可通过将HO与其他成分如KMnO、CaO等复合配比处理果蔬，延缓果蔬贮藏品质的下降。后期还可对外源HO处理采后荔枝转录组进行测序分析，分析HO是如何对采后荔枝相关褐变及ROS代谢的基因进行表达，深入研究HO对采后荔枝贮藏品质的影响机理。

此外，本研究在测定失重率、MDA含量、相对电导率、O产生速率、PPO活性和SOD活性等指标时，由于不同原因导致的标准误差较大。如失重率的测定中标准误差过大可能是因为选取的采后荔枝虽大小相近，但荔枝存在个体差异性，随着贮藏时间的延长水分流失速度不一样而造成；相对电导率测定中部分数据标准误差过大的原因可能是煮沸过程及补水过程的误差；SOD活性测定部分数据标准误差偏大的原因可能是受光不均匀影响了后续的吸光度测定等。但通过进一步统计，各处理相对标准差均低于20%，属于合理误差范围内。

4 结论

本研究结果表明，采用5 mmol/L外源HO处理采后荔枝，最能减缓荔枝褐变程度和ROS累积，维持细胞膜的完整性，延缓果实品质下降。说明适宜浓度的外源HO处理可调节采后荔枝ROS代谢，过量的HO处理则会导致果实的衰老和褐变。