辽宁省药用植物白鲜病害种类调查及病原鉴定

智 慧, 周如军, 郝 宁, 李自博, 陈计澎, 朴静子

(沈阳农业大学, 沈阳 110866)

白鲜DictamnusdasycarpusTurcz.为芸香科白鲜属多年生草本药用植物[1],广泛分布于中国、日本和韩国,我国东北、华北、西北及华东等地区均有丰富的野生资源[2-3]。白鲜以根皮入药,富含白鲜碱(dictamnine)、梣酮(fraxinellone)、黄柏酮(obacunone)等多种活性成分,在传统中医药中用于治疗湿疹、风湿热痹和疥癣疮毒等症[4-5]。现代药物学研究表明,其挥发油、醇提物和水提物中生物活性成分还具有抗癌、消炎和杀虫[6-7]等功效,有极高的药用价值和经济价值。随着白鲜野生资源枯竭、经济效益逐渐提高及市场需求量的日益增加,近年来,辽宁抚顺和本溪等地开始大面积人工栽培。栽培区域和种植面积的逐渐扩大使其病害问题日渐突显,现已成为制约白鲜种植业发展的主要瓶颈问题之一。

白鲜与五味子、细辛等辽宁传统道地药用植物相比人工栽培历史较短,研究基础相对薄弱,国内外文献仅见灰斑病、茎点霉叶斑病和立枯病记载。茎点霉叶斑病在韩国和中国吉林白鲜种植区发生普遍,发病率可达100%,病原为Phomadictamnicola[3,8,17]。吉林白鲜生产中还发现由Rhizoctoniasp.引致的苗期立枯病[9]危害。作者研究团队前期调查发现,白鲜灰斑病为辽宁新发生病害,辽宁抚顺地区发生普遍,危害严重,病田率100%,病株率42%～78%[12],鉴定病原为Paracercosporadictamnicola[10],并进一步开展了生物学特性研究[11]。近年来,辽宁白鲜种植区域和种植面积逐渐扩大,为了进一步明确生产中病害种类及危害情况,本文系统开展了病害调查和病原鉴定工作,旨在为白鲜病害的田间识别诊断和病害防控策略制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查

2018年-2020年生长季,对辽宁本溪、清原和西丰等白鲜主要种植区进行病害调查,对每个种植区的白鲜田块进行随机调查,调查田块数量不少于3块,采用五点取样法,每点随机调查100株,记录病害症状和危害程度,分别计算病害的病叶率、病株率和病情指数[13],并对危害部位和典型症状进行拍照。白鲜灰斑病和茎点霉叶斑病分级标准如表1所示。

表1 白鲜灰斑病及茎点霉叶斑病分级标准Table 1 Standard of gray leaf spot and leaf spot of Dictamnus dasycarpus

病株率=发病株数/调查总株数×100%;

病叶率=发病叶片数/调查总叶片数×100%;

1.2 形态鉴定

白鲜灰斑病、茎点霉叶斑病和根腐病采用常规组织分离法进行病原真菌分离[15],取具有典型症状的白鲜病叶和病根,在病健交界处切取5 mm×5 mm小块病组织,75%乙醇浸泡5～10 s,经20%次氯酸钠表面消毒3～5 min,无菌水洗3次,将病组织置于PDA平板上,25℃恒温培养,逐日观察,挑取菌落边缘菌丝于PDA上纯化后置于4℃冰箱保存。对于白鲜立枯病,将染病茎基部切成小块病组织,用无菌水清洗后放入WA平板上, 25℃恒温培养,菌落长出后挑取边缘菌丝于PDA平板进行纯化培养。参照谢辉[16]的方法,对根结线虫2龄幼虫和4龄幼虫进行形态学特征观察。以上病原结合形态学和培养性状参照相关文献鉴定病原种类[17]。

1.3 分子鉴定

1.3.1DNA提取

将4种供试白鲜真菌病害的菌丝块置于铺有无菌玻璃纸的PDA上,25℃恒温光照条件下培养7 d后收集菌丝。取烘干的菌丝,液氮研磨,采用改良的CTAB法提取菌丝DNA[18]。线虫DNA的提取参照彭德良等[19]的方法。

1.3.2PCR反应条件

供试病原真菌分子鉴定ITS引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[20]。LSU引物为NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)[21]。根结线虫ITS引物M18S(5′-AACCTGCTGCTGGATCATTAC-3′)和M28S(5′-GTATGCTTAAGTTCAGCG-3′)[22]。 PCR体系:Mix 9.5 μL,上下游引物各 1.0 μL,DNA 1.0 μL和ddH2O 12.5 μL, 共25 μL。PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。将所得PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,条带清晰的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,获得基因片段序列。

1.4 致病性测定

白鲜灰斑病和茎点酶叶斑病致病性测定均选取长势一致的健康叶片,使用10 μL 1.0×106个/mL孢子悬浮液喷雾接种,25℃保湿培养,以无菌水为对照组,每试验重复3次,逐日观察发病情况。

白鲜根腐病和立枯病致病性测定则选取长势一致的1年生植株,将10 μL 1.0×106个/mL孢子悬浮液灌入根茎部,无菌水为对照组,25℃保湿培养,每试验重复3次,逐日观察发病情况。

2 结果与分析

2.1 白鲜病害种类及危害情况

2018年-2020年对辽宁本溪、清原和西丰等7个白鲜种植区进行系统调查,结果显示(表2),近年来辽宁省白鲜主要病害有5种,分别为灰斑病、茎点霉叶斑病、立枯病、根腐病和根结线虫病。其中,灰斑病、茎点霉叶斑病和立枯病分布较广。本溪地区白鲜灰斑病和茎点霉叶斑病的发生最为严重,且发病率呈递增趋势,2018年病株率分别高达100%和93.3%,病情指数分别为29.6和19.2,2019年病株率分别为100%和99%,病情指数分别达29.9和19.6。宽甸地区白鲜立枯病发生最为严重,病田率高达19.0%。白鲜根腐病和根结线虫病发生较轻,其中根结线虫病仅在本溪地区发生。

白鲜叶部病害分布广、危害重,其中灰斑病在7个地区均有分布,且本溪、西丰、清原、新宾、沈阳和宽甸地区的病株率均为100%,茎点霉叶斑病在4个地区均有分布,其中本溪地区危害最重,2018年病株率高达93.3%。白鲜根及茎部病害也均有发生,立枯病在7个地区均有分布,病株率高达19%,而根腐病零星发生。

调查中发现,白鲜病害地区间分布显著不均衡,其中本溪和清原地区病害种类最为丰富,5种病害在本溪地区均有分布,而新宾和宽甸等地区为新发展区域,白鲜种植年限短,病害种类和严重度相对较轻。

2.2 白鲜叶部病害症状及病原

2.2.1灰斑病

白鲜灰斑病主要危害叶片,发病初期叶片产生黄褐色小斑点,病斑逐渐扩展,呈椭圆形或多角形灰褐色病斑,有黄色晕圈,病斑上具深褐色针尖大小粒状物。发病严重时,病斑互相愈合成不规则病斑,明显受叶脉限制形成多角形,后期导致黄化提早落叶(图1a～b)。

病菌在PDA培养基上生长缓慢,气生菌丝不发达,培养基内菌丝颜色较深,中心稍突起(图1c)。子座直径50～125 μm,分生孢子梗浅棕色,直立或弯曲,(25.0～75.0)μm×(2.5～5.8)μm, 0～4隔。分生孢子近无色或淡青黄褐色,倒棍棒至圆柱形,少直立,多弯曲至明显弯曲,个别成S形,大小(82.5～227.5)μm×(3.8～6.3)μm,5～16隔(图1d～e)。结合病原形态、培养性状、分子测序和致病性测定,并参考相关文献[10-12]鉴定病原为白鲜拟尾孢Paracercosporadictamnicola。

图1 白鲜灰斑病田间症状和病原形态Fig.1 Symptom and pathogen characteristics of gray spot disease on Dictamnus dasycarpus

2.2.2茎点霉叶斑病

白鲜茎点霉叶斑病主要危害叶片,发病初期,出现边缘深褐色中间褐色小斑点,随后病斑扩展呈圆形或椭圆形,中央灰白色、边缘褐色,病斑边缘出现明显黄色晕圈。病斑易出现大量小黑点,即分生孢子器。发病严重时导致整株叶片变黄,叶片边缘卷曲枯萎,直至脱落(图2a～b)。

病原菌在PDA培养基上呈圆形或近圆形,菌丝初期呈白色绒毛状,后期呈深褐色,培养10～15 d后,可见大量黑色分生孢子器,呈轮纹状分布。分生孢子椭圆形、肾形,单孢,无色,两端各含1个油球,大小为(4～9.5)μm×(1.3～4.2)μm(图2c～d),结合病原形态、培养性状、分子测序和致病性测定,并参考相关文献[3,23]，鉴定为白鲜茎点霉Phomadictamnicola。

图2 白鲜茎点霉叶斑病症状和病原形态Fig.2 Symptom and pathogen characteristics of leaf spot disease on Dictamnus dasycarpus

2.3 白鲜根部病害症状及病原

2.3.1根腐病

白鲜根腐病主要危害2～5年生植株。主要侵染根部,发病初期地上部分出现黄化、枯萎,土壤湿度大时根茎交界处可见白色棉絮状菌丝体,茎基部或地下根腐烂、根皮易脱落,呈朽腐状,严重发生导致整株枯死(图3a～b)。

图3 白鲜根腐病症状和病原形态Fig.3 Symptom and pathogen characteristics of root rot disease on Dictamnus dasycarpus

病菌在PDA培养基上气生菌丝发达,菌丝白色质密,生长速率为0.88 cm/d。分生孢子分为小型分生孢子和大型分生孢子,小型分生孢子单孢,卵形,大小为(5.4～7.9)μm×(2.1～3.8)μm;大型分生孢子镰刀形,两端细胞稍尖,少许弯曲,有2～3个隔膜,大小为(17.7～26.1)μm×(3.0～4.3)μm(图3c～d)。结合病原形态、培养性状、分子测序(Accession No.MT154248)和致病性测定,鉴定病原为尖镰孢Fusariumoxysporum。

2.3.2立枯病

白鲜立枯病主要在一年生幼苗期发生,主要危害白鲜茎基部,发病初期可观察到个别幼苗发病,病株叶片枯黄萎蔫,茎基部逐渐缢缩,严重时,病斑深入茎内,环绕整个茎基部,致使幼苗枯萎死亡,最终倒伏。田间发病中心明显,并迅速向四周蔓延,幼苗成片死亡,常造成缺苗断垅现象(图4a～b)。

图4 白鲜立枯病症状和病原形态Fig.4 Symptom and pathogen characteristics of damping-off disease on Dictamnus dasycarpus

病菌在PDA培养基上初期为灰白色或淡黄色,后变黄色或黄褐色。菌丝初期无色,纤细,后期粗壮,黄褐色至深褐色,隔膜明显,分支基部稍缢缩,与主菌丝成直角,直径为3.3～8.2 μm(图4c)。结合病原形态、培养性状、分子测序和致病性测定,鉴定病原为立枯丝核菌Rhizoctoniasolani。

2.3.3根结线虫病

主要危害白鲜根部,尤其在须根上生成大量大小不等的根结,田间发生中心明显,传播速度快。发病初期地上部症状不易诊断,但随着根系受害加重,地上部植株出现叶片无光泽、易萎蔫黄化、叶缘卷曲。发病植株较健康植株生长明显受到抑制,叶片少且小,植株矮化,根短小,后期地上部分枯萎死亡(图5a～b)。

图5 白鲜根结线虫病症状和病原Fig.5 Symptom and pathogen characteristics of Meloidogyne hapla on Dictamnus dasycarpus

雌虫白色,体梨形或球形,颈短,头区大,无环纹,口针纤细,基球圆形和杆部有明显界线,锥部向背部稍稍弯曲,杆部末端最宽,会阴花纹圆形或略带方形。背弓扁平,线纹平滑到波浪形,尾端区通常有刻点(图5A～D)。雄虫头不突出,头端平截到半球形,头区通常和身体有明显的界线,并宽于第一体环,口针细长,基部球圆形,侧区4条侧线,尾部钝圆,交合刺弯曲,具一尖突,引带半月形,两端稍细长。2龄幼虫蠕虫状、后端细,头不突出,头区不缢缩,平截锥形,口针基球圆形,唇后无环纹,侧区4条侧线,具不规则横纹,半月体紧靠排泄孔前,尾末端渐细,有3～5缢痕,末端钝锥形,尾部有明显透明区(图5E～F)。结合形态测定和分子测序(Accession No. ITS:MK610794; 18S: MK610792),鉴定病原为北方根结线虫Meloidogynehapla[24]。

3 讨论

近年来中药材种植已成为农业种植业结构调整、农业供给侧改革和脱贫攻坚的主要产业之一。白鲜是辽宁道地药用植物,由于野生资源逐渐枯竭,近年来开始人工归圃,随着市场需求的增大,经济效益的提高,栽培面积逐年增加,同时病虫害发生危害也明显加重。本文对本溪、清原和西丰等7个白鲜种植区开展了系统的调查工作,发现白鲜病害种类较多,新病害频发。目前,生产上主要病害有5种,分别为由Phomadictamnicola引起的茎点霉叶斑病、Paracercosporadictamnicola引起的灰斑病、R.solani引起的立枯病、F.oxysporum引起的根腐病和M.hapla引起的根结线虫病。其中,茎点霉叶斑病和灰斑病分布广且危害重,病株率分别为17.6%～99.0%和38.2%～100.0%。

药用植物生产研究是中药研究与开发的关键环节,健康优质种苗是中药材生产的基础。调查中发现,白鲜苗期病害发生相对严重,主要为立枯病和根结线虫病。其中,立枯病发生最为普遍,调查地区育苗田均有发生,病株率为0.6%～19.0%。根结线虫病主要在本溪地区发生,2018年病田率为20%,病株率平均9.1%,病害传播扩散速度极快,且难以根治。由于中药材生产面对市场经济的生产组织体系尚未完善,地区间种苗调运尤为频繁,种苗及根基土壤可以携带大量的病原生物,造成远距离传播危害[25-26]。白鲜作为辽宁一种新兴的中药材种类,正处于蓬勃发展期,立枯病和根结线虫病是中药材生产中重要的土传病害,可以随种苗调运、土壤和苗期喷灌进行远距离和近距离传播,存在较大的传播风险,应密切关注和重点防范。

名贵药用植物常为多年生,随着种植年限的增加,病害发生逐渐加重,其主要原因为病原生物的逐年积累。白鲜通常人工种植3～5年[27],栽培周期较长。调查发现,辽宁本溪和清原地区白鲜种植相对较早,经过多年种植,该地区白鲜生产中病害种类最为丰富,且新病害频发,危害严重,除本文鉴定的5种病害外,同时还发现多种生理性病害及柑橘凤蝶PapilioxuthusLinnaeus、金凤蝶P.machaonLinnaeus和棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)等害虫取食为害,而新宾、辽中和西丰等新种植区,多为1～3年生植株,病害种类相对较少,且危害轻,但随着种植年限的增加,病虫害防控亦不容忽视。由于白鲜病虫害研究相对薄弱,发生条件、侵染特性和流行动态尚未明确,缺乏规范化防控技术,难以满足生产中病虫害防控需求,应尽快开展发生条件、流行动态、致病机制及防治技术等相关研究工作,以保障辽宁白鲜产业的健康可持续发展。