基于同步辐射显微CT的肾结石微观结构特征研究

解莹馨, 王一惟, 薛艳玲， 邓 彪， 彭冠云*

1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院肾内科， 上海 200011

2. 上海交通大学医学院附属第九人民医院泌尿外科， 上海 200011

3. 中国科学院上海高等研究院上海光源中心， 上海 201204

4. 中国科学院上海应用物理研究所， 上海 201204

引 言

泌尿系结石是全球的泌尿系统常见病、 多发病， 据统计， 约11%男性和7%女性罹患肾结石[1-2]。 泌尿系统任何部位均可发生结石但常原发于肾。 我国肾结石患病率稍低于欧美洲国家， 男性约为10.3%， 女性约为6.6%[3]。 虽然肾结石的诊断及治疗技术在过去的几十年中已取得很大的进步， 但其发病率和复发率仍高居不下， 且发病率有日渐上升的趋势[3]。 结石可导致肾积水， 损伤肾功能， 甚至诱发出现危及生命的情况， 如严重的泌尿系感染和终末期肾病等[4-6]。 因此， 增加对于肾结石发病机制认识以便开展针对性的治疗方法是提高治疗肾结石成功率的关键。

肾结石病因较复杂， 结石形成机制尚不清楚， 目前提出了各种各样的有关肾结石病因的学说， 主要是从人体种族遗传、 疾病、 代谢和饮食习惯等方面研究结石病因， 从而产生不同种类的结石， 再确定治疗方案。 对结石本身的研究， 主要集中在结石的成分上。 肾结石主要以含钙结石为主， 其中又以草酸钙结石最多， 约占肾结石的(65.9%～90%)[7-8]。 然而， 若能直观观察到结石的内部结构， 并根据这些结构特征推断出结石的形成和成长轨迹， 无疑能对治疗患者肾结石和预后起到重要作用。 因传统的研究手段难以无损获得结石的内部结构， 目前， 还不曾见到肾结石微观结构相关报道。 而高分辨率显微CT特别是同步辐射X射线显微CT的出现， 无疑能为这一研究提供最先进的检测手段[5-7]。

上海同步辐射光源作为第三代优质同步辐射光源， 具有高光子通量、 高准直性、 高极化性、 高相干性及宽频谱范围等优点， 其配合高分辨的X射线探测器可实现精确、 灵敏的组织结构信息的快速、 无损检测， 在保持标本完整性的前提下， 清晰再现样品内部的三维显微结构， 从而克服了传统的二维切片技术存在破坏组织结构的完整性、 无法准确获得组织结构的三维空间信息和基质成份等局限性。 X射线成像及生物医学应用光束线站(BL13W1)是上海光源首批运行的七条线站之一。 该线站利用插入件扭摆器作为光源， 以双晶单色器将白光转为单色光， 主要开展单色X射线成像实验研究， 发展了多种X射线成像方法， 如吸收成像、 同轴相衬成像等， 从而克服了传统的二维组织学切片染色技术存在破坏组织结构的完整性、 无法准确获得组织结构的三维空间信息和基质成份等局限性， 为本研究提供了先进可靠的技术手段[9-10]。

本研究以不同患者肾结石为探测目标， 依托上海同步辐射光源， 通过利用同步辐射X射线显微CT技术， 探测肾结石结构， 为进一步深入研究结石病因的形成与生长机制以及肾结石的科学防治提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料

收集草酸钙肾病患者的结石32例， 上海交通大学医学院附属第九人民医院提供。

1.2 方法

在上海光源BL13W1光束线站进行显微CT扫描。 BL13W1为Wiggler光源， 最大束斑尺寸为45 mm(H)×5 mm(V) @30 m@20 keV， 光子通量密度为6×10 phs·s-1·mm-2@20keV@Si111, 光子能量可调范围在8～72.5 keV， 能量分辨率(ΔE/E)为<5×10-3， 该线站采用同轴法其系统极限分辨率可达亚微米级。

选择能量26 keV, CCD单像素尺寸为3.25 μm， 样品到CCD距离13 cm。 所获取的图像用ImageJ软件进行分析。

2 结果与讨论

结石内部结构差异明显， 可归纳为6种类型(图1)： Ⅰ两相密实型； Ⅱ结晶型； Ⅲ连续多层沉积型; Ⅳ非连续多层沉积型； Ⅴ镶嵌式多孔型； Ⅵ复合型。 其特征如下：

Ⅰ两相密实型： 结石由密度差异明显的两相组成， 结石内部基本密实或有少量空隙， 没有明显的层状结构。 Ⅱ结晶型： 分Ⅱa型和Ⅱb型， Ⅱa型颗粒和结晶体相对均匀分散， 孔隙较多； Ⅱb型中结晶体颗粒分布在结石的一侧， 而结石另一侧密度差异相对较少， 孔隙相对较少， 结石棱角清晰。 Ⅲ连续多层沉积型： 具有明显的层状结构， 且层状结构连续。 Ⅳ非连续多层沉积型： 有明显的层状结构， 层状结构断裂不连续。 Ⅴ镶嵌式多孔型： 结石由密度差异较大的两相组成， 有较多的不同尺寸大小的孔隙分布在结石之中。 Ⅳ复合型： 兼连续多层沉积型和镶嵌式多孔型结构， 连续多层沉积部分分层明显， 且分层连续、 致密， 少孔隙； 而多孔部分孔隙多， 成蜂窝状。

图1 肾结石显微CT结构(6种类型， 标尺为200 μm)

肾结石形成机制复杂， 形成过程包括成核、 生长、 聚集、 固相转化等几个阶段， 然而目前越来越多的研究者强调肾小管上皮细胞与结石晶体间的相互影响， 即只有在肾小管上皮损伤情况下， 尿中的钙晶体才能够黏附、 生长和聚集， 形成结石。 在近期的研究中发现结石中存在许多尿蛋白, 主要包括骨桥蛋白(OPN)、 Tamm-Horsfall蛋白(THP)、 尿凝血酶原片段1(UPTF1) 、 肾钙蛋白(NC)等, 这些蛋白与肾结石的形成关系密切[10-12]。 假设基质蛋白与矿物质， 如混凝土中的水泥和沙石， 基质蛋白能起到黏结胶合作用。 因肾结石复发率高， 获得结石的微观结构， 分析患者产生不同的种类的结石， 积极探索结石的生长机制， 科学确定治疗和预后方案， 无疑能有助于肾结石更为有效的治疗。

研究表明， 显微CT无损检测能获取到清晰的肾结石内部结构。 肾结石内部的结构有较大差异， 表明结石形成的复杂性。 本研究中通过观察归纳出的6种类型中， 其中连续多层沉积型、 非连续多层沉积型和复合型能明显看到结石分层结构， 体现出结石清晰的生长轨迹。 而从两相密实型、 结晶型和镶嵌式多孔型显微CT图中推测不出肾结石的生长过程， 需要对其更深入的跟踪研究。

3 结 论

通过收集肾结石患者的结石样本32例， 利用SR-μCT(能量为26 keV， CCD单像素尺寸3.25 μm)对其精细结构进行了解析。 实验结果表明， 显微CT能清晰获得结石内部微观结构； 肾结石内部结构差异明显， 可归纳为6种类型： Ⅰ两相密实型； Ⅱ结晶型； Ⅲ连续多层沉积型; Ⅳ非连续多层沉积型； Ⅴ镶嵌式多孔型； Ⅵ复合型。 本研究结果对进一步深入揭示肾结石生长机制及对肾结石更为科学有效防治提供了一新的研究方法和科学视角。