生物素标记重组猪圆环病毒2d基因型毒株感染性克隆的构建与鉴定

林小枫 ， 刘梅雪 ， 袁玮艺 ， 张琼歌 ， 朱 磊 ， 杜 谦

(1.西北农林科技大学动物医学院 ， 陕西 杨凌 712100 ； 2.杨凌金海生物技术有限公司 ， 陕西 杨凌 712100)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是目前严重危害养猪业的一种重要病原。PCV2感染能抑制机体免疫，导致猪圆环病毒病综合征(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)，且PCV2在猪群中的持续存在，给养猪业造成了巨大的损失[1]。PCV2的单链环状DNA基因组包含2个主要的编码框(Open reading frame，ORF)，即ORF1和ORF2。可根据ORF2基因序列的差异将PCV2分为8个不同的基因型，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d是主要的流行基因型[2]。猪群中最早流行PCV2a基因型，然后转变为PCV2b，目前正缓慢转变为PCV2d[3-4]。虽然有报道称，目前市场上销售的基于PCV2a基因型毒株的疫苗对于PCV2d基因型毒株的保护效果与PCV2a基因型毒株相当，但临床仍存在已接种PCV2a基因型毒株疫苗的猪发生PCVAD，因此PCV2临床毒株可能突破疫苗免疫保护[5]。原核生物素连接酶(Prokaryotic biotin ligase，BirA)是原核生物调控生物素合成的酶，生物素受体肽(Biotin acceptor peptide，BAP)是一种广泛使用的15 aa标签肽，其可被插入目的蛋白，使目的蛋白被BirA高效识别并标记生物素[6]。利用BirA-BAP标记系统获得生物素化PCV2d毒株可为后续进一步研究PCV2d感染突破疫苗免疫保护的具体机制提供材料。

本试验从陕西咸阳某临床发病猪场采集17头仔猪的血清、脾脏和淋巴结等组织样本，PCR检测发现其中5头仔猪为PCV2阳性，经测序发现1头仔猪感染了PCV2d基因型毒株。将PCV2d基因组orf2序列中226～246 bp替换为BAP编码序列后，环化并转染稳定表达BirA的PK15细胞，经连续传代5次后，获得生物素标记的重组PCV2d基因型毒株，本结果将为后续开展PCV2d基因型毒株免疫逃避机制研究提供有效的工具。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2头临床发病仔猪和15头未发病仔猪的血清、脾脏和淋巴结等组织样本均采集自陕西咸阳武功县某养殖场。

1.2 细胞、菌株和质粒 PK15细胞、大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞和pCI-neo-N1质粒，由本实验室保存；pMD-18T质粒，购自TaKaRa公司。

1.3 主要试剂 2×TaqMaster Mix(Dye plus)和T4连接酶，均购自南京Vazyme公司；SacⅡ、BamH Ⅰ和XhoⅠ等内切酶，均购自TaKaRa公司；M5 DL2 000 plus DNA Marker，购自北京聚合美公司；Lipo6000，购自碧云天公司；鼠抗BirA单克隆抗体，购自NOVUS公司；HRP标记链霉亲和素，购自Santa Cruz公司；鼠抗PCV2 Cap多克隆抗体，由本实验室制备并保存。

1.4 试验方法

1.4.1 引物设计 根据已报道的PCV2(GenBank：MH492006)序列，设计PCV2全长扩增引物PCV2-F和PCV2-R，以及PCV2检测引物PCV2JC-F和PCV2JC-R；根据PCV2 Cap编码序列的Loop CD区域(L75PPGGGSN82)，设计引入BAP标签(GLNDIFEAQKIEWHE)序列的Overlap引物BAP-F和BAP-R；根据大肠埃希菌的BirA基因序列(GenBank：M10123.1)设计引物BirA-F和BirA-R。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.2 基因组DNA的提取 将采集的组织样本或细胞经-80 ℃反复冻融，离心取上清。在收集的上清液中加入1%终体积SDS和0.5 mg/μL终浓度蛋白酶K，颠倒混匀1 min，56 ℃水浴30 min。加入等体积DNA提取液，震荡混匀5 min后，12 000 r/min离心5 min。吸取上清，加入等体积氯仿，混匀5 min后，室温12 000 r/min离心5 min。吸取上清，加入1/10体积2 mol/L乙酸钠和2倍体积无水乙醇，-80 ℃过夜。4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤2次，4 ℃离心弃上清，自然风干后加入ddH2O溶解，置于-20 ℃备用。

1.4.3 PCV2基因组扩增和遗传进化分析 利用PCV2检测引物PCV2JC-F和PCV2JC-R对提取的17份组织DNA样品进行PCR检测，设置阳性对照和阴性对照。对于PCV2阳性DNA样品，利用PCV2全长引物进行PCV2全基因组PCR扩增，回收PCR产物，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。为了明确所扩增PCV2的基因型，利用MEGA 5.10软件，采用邻接(Neighbor-joining,NJ)法，并进行1 000次自举重复，对测序结果进行遗传进化分析。

1.4.4 重组质粒T-PCV2d-BAP的构建 根据获得的PCV2d DNA中orf2的226～246 bp序列，分别利用Overlap引物BAP-F和PCV2-R、PCV2-F和BAP-R进行PCR扩增，获得产物片段1和片段2，以片段1和片段2共同为模板，利用PCV2-F和PCV2-R进行PCR扩增，获得重组PCV2d-BAP目的片段。将其克隆入pMD19-T载体，转化E.coliDH5α后挑取单克隆，扩大培养并提取质粒，分别进行PCR及SacII酶切鉴定，并进一步测序鉴定，将构建成功的重组质粒命名为T-PCV2d-BAP。

1.4.5 重组质粒pCI-BirA的构建 取3 mLE.coliDH5α饱和菌液，离心弃上清，STE洗涤1次，加入500 μL TE缓冲液，沸水浴10 min后，以12 000 r /min离心15 min，取上清作为PCR模板。利用BirA-F和BirA-R进行PCR扩增，条件为：95 ℃预变性10 min,94 ℃ 40 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环后，再于72 ℃延伸10 min。回收PCR产物，利用BamH I和XhoI双酶切，同时对pCI-neo-N1质粒进行双酶切，回收酶切产物，用T4连接酶于16 ℃过夜连接，转化E.coliDH5α后挑取单克隆并扩大培养，提取质粒后经PCR、双酶切和测序鉴定，将构建成功的重组质粒命名为pCI-BirA。

1.4.6 稳定表达BirA的PK15细胞系的构建及鉴定 将状态良好的PK15细胞以6×104个/孔铺制24孔细胞板，置于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱培养。待细胞密度达到70%左右时，利用Lipo6000将构建好的重组质粒pCI-BirA转染至PK15细胞，48 h后加入G418进行筛选，获得单细胞克隆后扩大培养。收取扩大培养的细胞，提取细胞mRNA，反转录为cDNA后，PCR扩增BirA基因编码序列，同时Western blot检测细胞中BirA蛋白的表达，PCR和Western blot阳性细胞克隆即为稳定表达BirA的PK15细胞系。

1.4.7 生物素标记PCV2d基因型毒株的获得及鉴定 利用内切酶SacII将T-PCV2d-BAP酶切，获得PCV2d-BAP编码序列，将其以T4连接酶于16 ℃连接过夜，连接产物经纯化后，转染至稳定表达BirA的PK15细胞，盲传5代后，收取细胞，裂解并收集上清，提取DNA，利用PCV2特异性引物进行PCR检测，同时将获得的细胞上清再次感染PK15细胞，裂解细胞后，以鼠抗PCV2 Cap多克隆抗体和HRP标记的链酶亲和素进行Western blot检测，阳性毒株即为生物素标记PCV2d基因型毒株。

2 结果

2.1 临床样本的检测及PCV2d全基因组扩增 将采集的2头发病仔猪和15头未发病仔猪样本，分别提取DNA后，以PCV2特异性检测引物进行PCR扩增，结果显示，2头发病仔猪均为PCV2阳性，15头未发病仔猪中有3头为PCV2阳性(图1A)。分别将5头PCV2核酸阳性仔猪样本中的PCV2全基因组DNA进行PCR扩增，均得到大小约为1 760 bp的目的条带(图1B)。对目的条带进行测序，并进行遗传进化分析，结果显示，扩增的5条目的条带中有1条为PCV2d序列，扩增自1头发病仔猪的组织样本，其余4条为PCV2b序列，分别来源于另一头发病仔猪和3头未发病仔猪(图1C)。

图1 临床样本PCR检测及PCV2d全基因组遗传进化分析Fig.1 PCR detection of clinical samples and genetic evolution analysis of PCV2d whole genomeA：17份临床样本PCV2特异性PCR扩增(M：DNA标准DL2 000 plus； 1:阳性对照； 2:阴性对照； 3～17:临床未发病仔猪组织样本； 18、19:临床发病仔猪组织样本);B:5份阳性样本PCV2全基因组PCR扩增(M:DNA标准DL2 000 plus； 1:阳性对照； 2：阴性对照； 3～7：PCV2阳性临床样本)；C：PCV2全基因组遗传进化树(▲：本试验扩增序列)A：PCV2 specific PCR amplification of 17 clinical samples(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-17:Clinical tissue samples from non-diseased pigs; 18,19:Clinical tissue samples from diseased pigs);B:PCV2 whole genome PCR amplification of 5 positive samples(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Positive control;2:Negative control; 3-7:PCV2 positive clinical samples);C:Phylogenetic tree of PCV2 genomes(▲:Sequences amplified in this study)

2.2 重组质粒T-PCV2d-BAP的构建 根据获得的1株PCV2d全基因组DNA中orf2的226～246 bp序列，设计引入BAP序列的Overlap引物，分别进行PCR扩增，获得大小约为842 bp的PCR片段1和大小约为1 028 bp的PCR片段2(图2A)。以片段1和片段2同时为模板，用PCV2全基因组引物进行PCR扩增，获得大小约为1 790 bp的PCV2d-BAP目的条带(图2B)，将其克隆入pMD19-T载体，经PCR及SacⅡ酶切鉴定，均获得了预期大小的目的条带(图2C)，测序鉴定正确，表明重组质粒T-PCV2d-BAP构建成功。

图2 重组质粒T-PCV2d-BAP的构建Fig.2 Construction of recombinant plasmid T-PCV2d-BAPA：PCV2d片段1和片段2的PCR扩增(M：DNA标准DL2 000 plus； 1:片段1； 2:片段2); B:PCV2d-BAP的PCR扩增(M:DNA标准DL2 000 plus； 1:PCV2d-BAP);C:重组质粒T-PCV2d-BAP的Sac Ⅱ酶切鉴定(M:DNA标准DL2 000 plus； 1:Sac II酶切鉴定产物)A:PCR amplification of fragment 1 and fragment 2 of PCV2d(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Fragment 1; 2:Fragment 2); B:PCR amplification of PCV2d-BAP(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:PCV2d-BAP);C:Identification of recombinant plasmid T-PCV2d-BAP by Sac Ⅱ enzymes digestion(M：DNA Marker DL2 000 plus; 1:Sac Ⅱ enzymes digestion products)

2.3 重组质粒pCI-BirA的构建 设计E.coliDH5αBirA基因特异性引物，经PCR扩增，获得大小约为966 bp的目的条带(图3A)，将其克隆入pCI-neo载体，经双酶切鉴定，获得大小约为966 bp的目的条带(图3B)，测序鉴定正确，表明已成功构建pCI-BirA重组质粒。

图3 重组质粒pCI-BirA的构建Fig.3 Construction of recombinant plasmid pCI-BirAA：BirA基因的PCR扩增(M：DNA标准DL2 000 plus； 1:BirA);B:重组质粒pCI-BirA的双酶切鉴定(M:DNA标准DL2 000 plus； 1:BamH I和Xho I双酶切产物)A：PCR amplification of BirA gene(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:BirA);B:Identification of recombinant plasmid pCI-BirA by double enzymes digestion(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:BamH I and Xho I double enzymes digestion products)

2.4 稳定表达BirA的PK15细胞系的构建及鉴定 将构建好的pCI-BirA重组质粒转染PK15细胞，48 h后加入G418进行筛选，获得单细胞克隆后扩大培养(图4A)，提取细胞mRNA并反转录后，PCR扩增BirA基因编码序列，结果显示获得了大小约为966 bp的目的条带(图4B)；Western blot结果显示，获得的细胞克隆表达BirA蛋白(图4C)，与预期大小一致，表明成功获得了稳定表达BirA的PK15细胞系。

图4 稳定表达BirA的PK15细胞系的构建及鉴定Fig.4 Construction and identification of PK15 cell line stably expressing BirAA：G418筛选后单克隆扩大培养的PK15细胞(100×)；B：PK15细胞系BirA mRNA的PCR鉴定(M：DNA标准DL2 000 plus； 1:BirA mRNA); C：PK15细胞系BirA蛋白的Western blot鉴定(WT:野生型PK15细胞； BirA:表达BirA的PK15细胞A：Expanded PK15 cells after G418 screening (100×);B：PCR identification of BirA mRNA in PK15 cell line(M:DNA Marker DL2 000; 1:BirA mRNA);C：Western blot identification of BirA protein in PK15 cell line(WT：Wild-type PK15 cells; BirA:PK15 cells expressing BirA)

2.5 生物素标记PCV2d基因型毒株的获得及鉴定 将环化的PCV2d-BAP转染稳定表达BirA的PK15细胞，盲传5代，经检测，成功获得大小约为352 bp的目的片段(图5A)。同时将获得的上清感染PK15细胞，裂解细胞后进行Western blot检测，结果显示，以鼠抗PCV2 Cap多克隆抗体和HRP标记的链酶亲和素均能检测到大小约为29 kDa的目的条带(图5B)，表明成功获得了生物素标记PCV2d基因型毒株。

图5 生物素标记PCV2d基因型毒株的获得及鉴定Fig.5 Obtain and identification of biotin-labeled PCV2d genotype strainA：细胞裂解上清PCV2特异性PCR鉴定(1：阳性对照； 2：细胞裂解上清； 3：阴性对照)；B：生物素标记PCV2d基因型毒株的Western blot鉴定(1:PCV2阳性对照； 2:生物素标记PCV2d基因型毒株； 3:阴性对照)A：PCV2 specific PCR identification of cell lysis supernatant(1:Positive control; 2:Cell lysis supernatant; 3:Negative control); B：Western blot identification of biotin-labeled PCV2d genotype strain(1:PCV2 positive control; 2:Biotin-labeled PCV2d genotype strain; 3:Negative control)

3 讨论

PCV2是目前已知最小的动物病毒，其基因组大小约为1 766～1 768 nt的单链环状DNA。在单链DNA病毒中，PCV2基因组具有最高的突变概率，每年能达到约1.2×10-3突变/位点[7]。PCV2基因组的这些突变使其可以被分为不同基因型，分别为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h[2,5]。在目前已报道的PCV2序列中，PCV2b基因型最多，其次是PCV2d基因型，第三是PCV2a基因型，这3种PCV2基因型均呈世界性分布[2]。从PCV2序列报道的时间上来看，最早报道的是PCV2a基因型，但大约从2002年开始，PCV2b基因型的报道增多，特别是2005年以后，PCV2b基因型开始成为主要的流行基因型[2]。随着PCV2基因组的持续突变，2010年以后PCV2d基因型的报道量急剧增加，并呈现逐渐取代PCV2b基因型成为主要流行基因型的趋势[2]。更重要的是，有研究显示，虽然目前广泛使用的基于PCV2a基因型毒株的疫苗能使免疫后的仔猪在被PCV2a、PCV2b或PCV2d基因型毒株感染时具有相似的保护作用，但在PCV2b和PCV2d基因型毒株感染的仔猪体内中和抗体的产生量相对较少[8]。目前，世界主要养猪国家已广泛使用PCV2疫苗对猪群进行免疫，但与此同时PCV2d基因型毒株报道增多，这可能与疫苗的选择压力有关[5]。事实上，早前已有报道显示，PCV2在疫苗选择压力下已经发生了免疫逃避进化趋向[9]。因此，对猪群中PCV2流行情况的持续监控，以及对流行PCV2基因型的进一步深入研究，将有助于更好地防控猪圆环病毒病。在本试验中，对临床发病的2头仔猪和同猪群未发病的15头仔猪的组织样本进行了PCV2核酸检测，结果显示，2头发病仔猪均为PCV2阳性，15头未发病仔猪中有3头为PCV2阳性，经进一步测序发现，两头发病仔猪中一头感染了PCV2d基因型毒株，另一头感染了PCV2b基因型毒株，3头未发病仔猪均为PCV2b基因型毒株感染，推测本试验检测猪群中感染的PCV2基因型仍以PCV2b为主，但出现了PCV2d基因型毒株导致的感染和发病。

PCV2基因组有2个主要的ORF，分别编码复制酶Rep/Rep′和衣壳蛋白Cap。前期研究发现，PCV2 Cap编码序列的Loop CD区域(L75PPGGGSN82)可在不改变病毒衣壳结构和入胞能力的情况下插入外源基因[10]。因此，本试验基于临床获得的PCV2d基因型毒株基因组，将Cap的Loop CD区域替换为生物素受体肽BAP编码序列，构建了能融合表达BAP标签的PCV2d基因型毒株全基因组。BAP是生物素连接酶BirA的底物，BirA-BAP系统是一种原核生物蛋白质翻译后生物素化修饰系统[11]。BirA可特异性地识别BAP，并将生物素分子共价结合至BAP的赖氨酸残基上。这种利用BirA-BAP系统的生物素化标记，已被用于纯化蛋白、标记抗体、蛋白功能研究和构建生物素标记重组病毒等[11-12]。本试验将构建的能融合表达BAP标签的PCV2d全基因组DNA经环化后，转染稳定表达BirA的PK15细胞，利用BirA-BAP系统获得了生物素标记的PCV2d基因型毒株。这种生物素标记的PCV2d基因型毒株将有助于进一步研究PCV2d基因型毒株的感染与免疫逃避机制。但是，这种PCV2d基因型毒株衣壳上标记的生物素能否持续稳定的存在，还需要多代次的扩增后进一步检测。

综上所述，本试验从临床发病猪群中获得了1株PCV2d基因型毒株全基因组序列，以此毒株序列为基础，利用BirA-BAP系统构建了生物素标记PCV2d基因型毒株感染性克隆，获得了生物素标记的PCV2d毒株，为后续开展PCV2d基因型毒株免疫逃避机制研究提供了基础。