响应面法优化松茸蛋白的提取工艺

赖雨微，张倩，高俊鹏，刘翔，王刚，陈光，李艳丽*

(1.吉林农业大学秸秆生物学与利用教育部重点实验室，长春 130118；2.武汉森澜生物技术有限公司，武汉 430120)

松茸(Tricholomamatsutake)，又名松口蘑、松菇、松菌、松蘑、合菌、大花菌、剥皮菌等[1]，位于中国“四大名菌”之首，享有“菌中之王”的美誉[2]。松茸是松栎等树木外生的菌根真菌，研究表明，松茸具有抗肿瘤、抗辐射、美白、抗氧化、预防糖尿病以及增强免疫力等营养和药用价值[3-5]，目前松茸子实体在亚洲和北欧均具有重要的商业价值[6]。在我国，松茸主要分布在东北、四川、云南等地，随着近年来研究的深入，美洲、欧洲和北美洲等地也相继有报道[7]。松茸含有蛋白、多糖、萜类、皂苷等多种物质，其中蛋白质含量明显优于其他食用菌，新鲜松茸中的粗蛋白含量可以达到20.07%，其中纯蛋白含量在8.8%～10%；烘干后松茸中的蛋白质含量也在13%，松茸中含有17种氨基酸和多种维生素，此外，松茸水解后的产物具有促进健康和改善生物体机能的功效[8]。

目前生物体获取的蛋白质来源于动物、植物和食用菌中[9]。而动物源蛋白质的开发周期长且在生产过程中会导致温室气体的排放[10]，食用后也可能造成心脑血管疾病等健康风险[11]。而植物源蛋白中往往必需氨基酸受限，比如豆类蛋白含硫氨基酸含量较低，谷类蛋白赖氨酸含量较低[12]，限制了其营养学价值。而食用菌中蛋白含量丰富[13]，与动、植物源蛋白质相比，具有更高的营养价值和安全性[14-15]。研究表明松茸菌丝体可以体外培养，有望进行半人工栽培[16-18]，相信随着生物技术的逐步发展，松茸的人工栽培技术终将实现。这些特性都将为松茸开发成为功能性食品配料提供理论依据。因此，将松茸中的功能性物质充分开发与利用势在必行。

国内外对于松茸蛋白提取的研究较少，主要集中在对松茸菌丝体中多糖或糖蛋白的提取以及其生物活性的研究，且利用超声辅助碱提优化松茸蛋白提取条件的研究尚未见报道。因此，本试验采用超声辅助碱提法对松茸蛋白进行提取，结合单因素试验进行Box-Behnken试验设计，对碱提松茸蛋白的工艺进行超声辅助优化，并在不同的pH下对松茸蛋白的功能性质进行测定，为松茸蛋白的提取和进一步综合开发利用提供了理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生新鲜松茸子实体、大豆油：市售；牛血清白蛋白：福州飞净生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠：均为分析纯，北京化工厂；硫酸铵：国药集团化学试剂有限公司。

SIN415-2903型酶标仪 Omega公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；TG2-16B型离心机 上海安亭科学仪器厂；Kjeltee-8400型全自动凯氏定氮仪 丹麦福斯分析仪器有限公司；KQ-250DV型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

将新鲜松茸清洗后切片阴干，于烘箱中50～60 ℃烘干至恒重，通风冷却后粉碎过70目筛，得松茸干粉，置于干燥环境下密封保存。

1.2.2 松茸蛋白的提取

1.2.2.1 碱提法提取松茸蛋白

经1.2.1处理的松茸蛋白，按照一定的固液比在一定pH下进行碱提，保持恒定温度提取一定时间，反应结束后以10000 r/min离心20 min，收集上清液，采用考马斯亮蓝G250法测定提取液中蛋白质含量。

1.2.2.2 超声辅助碱提法优化松茸蛋白提取工艺

在碱提法提取的基础上，优化超声辅助提取松茸蛋白的条件，调节一定固液比的反应溶液pH，在固定超声功率200 W下超声提取一段时间后，在恒温下提取一定时间，反应结束后以10000 r/min离心20 min，收集上清液采用考马斯亮蓝G250法[19]测定提取液中蛋白质含量。

1.2.3 松茸蛋白质含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制

配制100 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液，分别稀释到不同浓度，采用考马斯亮蓝G250法测定OD595处的吸光度，以蛋白质质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.2 样品中蛋白质含量的测定

参照考马斯亮蓝G250法测定样品溶液在OD595处的吸光值，根据标准曲线计算样品中松茸蛋白质量浓度，按下式计算蛋白质的提取率。

1.3 松茸蛋白碱提取的单因素试验

松茸干粉→不同pH的碱液(用0.20 mol/L NaOH调节碱提液pH)→调节碱提温度→稳定温度碱提一定时间。

以上述松茸蛋白碱提取的流程为基础，以松茸蛋白的提取率为指标，保持其他条件不变的情况下分别考察料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90)、碱提温度(40，50，60，70，80，90 ℃)、碱提时间(0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 h)和pH(7.5，8.5，9.5，10.5)对松茸蛋白提取率的影响。

1.4 超声辅助提取松茸蛋白

基于1.3中得到的最佳碱提条件，研究超声辅助提取时间对松茸蛋白提取率的影响。以松茸蛋白的提取率为指标，料液比为1∶50，在常温下进行超声后继续进行碱提，碱提条件参照1.3中得到的最佳蛋白提取条件，考察最佳超声时间(5，10，20，30，40 min)对松茸蛋白提取率的影响。

根据单因素试验优化的结果，考察在超声辅助的前提下碱提法中各单因素的变化对蛋白提取率的影响。由于料液比对松茸蛋白提取的影响很小，则固定料液比为1∶50，只选取影响显著的3个因素：温度(X1)、时间(X2)、pH(X3)。以松茸蛋白提取率为响应值，采用Box-Behnken设计与响应面分析软件设计三因素三水平响应面优化，对提取条件进行分析与优化，试验因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.5 固体硫酸法沉淀松茸蛋白

1.5.1 盐析法沉淀蛋白

向松茸蛋白提取液中加入不同质量的固体硫酸铵，缓慢搅拌使其溶解，在室温下匀速混合1 h，在4 ℃下静置过夜，将有沉淀析出的溶液轻摇混匀后，以10000 r/min离心20 min。用PBS缓冲液溶解沉淀得松茸蛋白溶液，测定溶液中蛋白含量，确定沉淀松茸蛋白的硫酸铵溶液最佳饱和度。

1.5.2 透析除盐

将松茸蛋白溶液置于透析袋中，4 ℃过夜，期间更换3次PBS缓冲液，进行透析除盐。

1.5.3 冷冻干燥

将透析后的松茸蛋白溶液进行冷冻干燥，得松茸蛋白冻干粉。

1.5.4 松茸蛋白的SDS-PAGE电泳检测

将适量松茸蛋白冻干粉用50 μL PBS (50 mmol/L， pH 7.5)缓冲液溶解，离心取15 μL样液与15 μL 2×Buffer混合后于沸水浴中煮沸10 min，冷却离心，每孔加20 μL上清液上样。采用12.5%的SDS-PAGE蛋白预制胶进行恒压(120 V)电泳，待溴酚蓝至前沿1 cm左右结束电泳，使用蛋白染色液进行凝胶染色。

2 结果与分析

2.1 松茸蛋白的提取

2.1.1 单因素对碱提法提取松茸蛋白的影响

2.1.1.1 料液比对松茸蛋白提取率的影响

由图1可知，在相同反应条件下，松茸蛋白的提取率随着固液比的逐渐增大而逐渐上升，但从1∶50开始松茸蛋白提取率的上升趋势逐渐变缓，提取率上升并不明显。这可能是由于在1∶50之前松茸干粉在溶液中的溶解还不完全，而随着料液比的逐渐增加，料液间的相互接触面积逐渐增加而使提取率上升，考虑到试验的经济实惠性，后续的试验采用固定1∶50的料液比进行。

图1 料液比对松茸蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of Tricholoma matsutake protein

2.1.1.2 pH对松茸蛋白提取率的影响

由图2可知，溶液的pH由6升高到7时，提取率迅速提高。高于7以后，提取率上升趋势变缓。当达到9.5时，提取率达到最大值，高于此pH，提取率下降。出现这种趋势的原因是溶液中合适的碱环境能够破坏松茸细胞壁，使松茸蛋白大量释放，进而呈现提取率不断上升的趋势，而过高的碱浓度会使美拉德反应的进行加快，使提取率下降，故本试验选取pH 9.5为松茸蛋白碱提法提取的最佳pH。

图2 pH对松茸蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of pH on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.1.3 时间对松茸蛋白提取率的影响

由图3可知，当提取时间由1 h提高到2.5 h时，提取率迅速升高，到2.5 h时达到最高值，此后提取率呈现下降趋势。出现这种情况的原因是在2.5 h前松茸细胞壁在碱液的作用下还未被完全破坏，使其内在的活性成分没有得到完全释放，而2.5 h后碱液破坏松茸蛋白释放的蛋白，导致蛋白提取率下降，故选择2.5 h为松茸蛋白碱提法提取的最佳时间。

图3 时间对松茸蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of time on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.1.4 温度对松茸蛋白提取率的影响

由图4可知，当溶液温度为75 ℃时，提取率最高，达到峰值。温度由50 ℃提高到75 ℃时，提取率迅速上升，当大于75 ℃后，随着温度升高，提取率迅速下降。出现这种情况的原因是逐渐升高的温度会导致细胞壁逐渐被破坏，使蛋白质加速释放，而当温度过高时溶液中析出的蛋白质发生变性从而导致提取率下降，故选择75 ℃为松茸蛋白碱提法提取的最佳温度。

图4 温度对松茸蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

综上，对松茸蛋白的碱提条件进行了单因素研究，确定了最佳条件：料液比为1∶50，pH为9.5，提取时间为2.5 h，温度为75 ℃，此时松茸蛋白提取率为4.9%。

2.1.2 超声辅助对碱提法提取松茸蛋白的影响

对松茸干粉溶液进行超声辅助碱提，研究超声时间对蛋白提取率的影响。由图5可知，超声时间为20 min时蛋白提取率最高，为5.6%，比单独使用碱提法提高了14%。

图5 超声时间对松茸蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.3 超声辅助碱提法提取松茸蛋白的响应面优化

2.1.3.1 响应面优化结果与分析

超声辅助碱提法提取松茸蛋白的响应面设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken松茸蛋白质提取优化试验设计及结果Table 2 Box-Behnken optimization test design and results of Tricholoma matsutake protein extraction

续 表

在超声辅助提取20 min的基础上，采用Design Expert 8.0.6.1软件对试验数据进行拟合分析，拟合二次方程为Y=8.02-0.31A-0.29B-0.25C+0.35AB-0.23AC+0.12BC-1.06A2-0.96B2-0.035C2。

2.1.3.2 二次回归模型的建立及显著性分析

由表3可知，模型的F=87.56，P=0.0001<0.05，说明该模型差异较显著；失拟项的P=0.1197>0.05,表明回归模型在可接受范围内。模型决定因素R2=0.9912，校正系数RAdj2=0.9799，说明松茸蛋白提取率与该模型拟合程度较高，能很好地反映各因素和响应值之间的关系。模型中A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2均小于0.05，说明A、B、C 3个因素及3个因素的交互项对松茸蛋白提取率均具有显著影响；C2值为0.5769>0.05，说明该项对松茸蛋白提取率无显著影响。综上所述，各因素对松茸蛋白提取率影响的主次顺序为时间>温度>pH。

表3 回归模型各项方差分析Table 3 Variance analysis of each item of regression model

2.1.3.3 响应面各因素交互作用分析及验证试验

3D曲面图平缓和陡峭的趋势可以直观、完整地反映出各因素对松茸蛋白提取率的影响。表面越陡，此因素对结果的影响越大，表面越光滑，则该因素对结果的影响越小。等高线图提供了两个独立变量之间相互作用的更直观视图。等高线图形状越接近椭圆，则相关性越大，而越接近法线圆，则相关性越小。

由图6～图8可知，在pH固定的前提下，松茸蛋白的提取率随着时间和温度的变化其变化幅度较大；而在温度和时间固定的前提下，松茸蛋白的提取率随着pH的变化其变化幅度较小。这也充分说明提取温度和时间对松茸蛋白提取率的影响较显著，对三维曲面图的分析与方差分析的结果较为一致。通过等高线图比较，温度与时间的相互作用不大，而时间与pH和温度与pH之间的相互作用较大。

综合分析以上结果并结合回归模型，确定松茸蛋白质的最佳提取工艺参数为时间1.46 h，温度74.00 ℃，pH 9.06，预测理论提取率为8.39%。根据实际情况，将提取时间调整为1.5 h，温度为74 ℃，pH值为9.0，进行验证，结果显示：蛋白提取率为8.30%±0.21%，与模型预测理论值基本一致，说明该模型可以模拟和预测松茸蛋白质提取率的变化。经过响应面法优化条件后，提取率比优化前提高了48%，比碱提法提高了69%。

2.2 不同饱和度的硫酸铵对松茸蛋白提取的影响

将松茸粗蛋白溶液进行硫酸铵盐析，结果见图9，蛋白质含量可以直观地反映在OD值上。上清液OD值随着饱和度的增加下降明显，达到90%时几乎检测不到蛋白。沉淀溶解后的OD值则恰好出现相反的趋势，当饱和度达到90%时，沉淀OD值达到最大，说明此条件下，蛋白质沉淀最完全。因此，确定硫酸铵饱和度为90%。

图9 硫酸铵饱和度对松茸蛋白提取率的影响Fig.9 Effect of ammonium sulfate saturation on the extraction rate of Tricholoma matsutake protein

2.3 SDS-PAGE检测结果

将松茸蛋白进行SDS-PAGE电泳,图10可知，松茸蛋白的亚基分布范围广泛。根据电泳结果，推算得出标准蛋白分子量(Mr) 与其相对迁移率(Rf) 之间的关系公式，即lgMr=-1.2861Rf+2.1461(R2=0.9926)。从而计算出松茸蛋白分子量集中在0.81～10.14 kDa区间，在14.3～0.81 kDa范围内条带较深，说明此范围蛋白质亚基种类多。

图10 松茸蛋白的SDS-PAGE电泳图 Fig.10 SDS-PAGE electropherogram of Tricholoma matsutake protein

3 讨论与结论

碱提法是提取植物蛋白最常用的传统方法[20]，该方法在食用菌中也有少量报道[21-22]，其原理为破坏细胞壁[23]，断裂二硫键[24]。蛋白质碱提过程中，一定范围内的温度、时间、pH对提取率的影响具有相似性。提高温度有助于细胞壁裂解，从而使提取率增加。提高pH会使蛋白质中的酸性氨基酸和中性氨基酸解离程度增加，从而溶解性增加使提取率增加。延长时间会增加蛋白质在溶剂中溶解并释放到胞外的机会，从而使提取率增加。但当温度、pH值、时间超过了阈值便会导致蛋白质变性,从而使提取率下降。这是因为蛋白质是生物大分子，在一定温度和pH的溶剂中过久暴露会引起变性，从而使提取率下降。综上，温度、pH和时间三者相互作用，只有恰到好处，方能获得最大提取率。本试验结果得出了与上述相一致的结论。

超声法提取蛋白质属于非传统的物理方法，是当今食品加工中最常用的技术之一[25]，已在食用菌中有少量报道[26]。超声提取的原理在于在超声频率范围内在溶剂中会产生大的空化泡，这些空化泡的崩溃导致极端的机械剪切力，使介质细胞壁被破坏，从而使提取率提高[27]。本研究发现超声20 min时提取率最高，超过20 min后下降，这是因为超声时间过短，难以破坏细胞壁；超声时间过长，蛋白质发生变性从而使提取率下降。

为进一步提高提取率，对超声辅助碱提法进行响应面优化，结果发现松茸蛋白提取率比优化前提高了48%，比单独碱提法提高了69%。这进一步证明响应面法是评价多因素交互作用从而优化工艺条件的有效方法[28]。此外，还发现与单独碱提法相比，最佳提取时间由2.5 h缩短到1.5 h，pH值由9.5下降到9.0。Sari等研究表明，不同来源的植物蛋白质采用碱提法提取，得到的提取率相差较大。谷物和豆类提取率较高，微藻类提取率较低，这主要取决于细胞壁成分。参考模式担子菌裂褶菌的细胞壁，其主要成分为不溶于碱的β-葡聚糖、几丁质及其他化合物[29-30]，这可能是单独碱提法提取率较低的主要原因，而超声辅助法可有效破坏细胞壁，从而使提取率提高。

本试验利用超声辅助碱提法提取松茸蛋白质，利用响应面法优化提取条件，最终确定了松茸蛋白质的提取工艺，为松茸蛋白质的开发与利用奠定了基础。