不同保鲜方式冷吃兔中挥发性风味物质的对比分析

张钰麟，陈泓帆，赵志平*，康馨樾，王卫，白婷，张佳敏，聂鑫，罗淮良

(1.成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106；2.成都医学院 基础医学院，成都 610083；3.自贡市泰福农副产品加工厂，四川 自贡 643000)

兔肉在我国有着悠久的历史，古人在几千年前就发现兔肉具有极高的营养价值，并予以兔肉“辛平无毒，补中益气”、“凉血，解热毒，利大肠”的评价[1]。兔肉具有“四高四低”的优点，四高即高蛋白质、高消化率、高不饱和脂肪酸以及高必需氨基酸；四低即低热量、低油脂、低胆固醇与低脲酸[2]。此外，兔肉含有丰富的维生素、氨基酸及多种矿物质，并且具有保健和美容的功效，是国际上公认的优质健康肉类。

冷吃兔是自贡市国家地理标志保护产品，深受消费者的喜爱。兔肉经水煮、高温油炸、炒制脱水后，保质期显著延长，且可以在常温下食用，故被称为“冷吃兔”。冷吃兔具有色泽红润、麻辣鲜香的特点，广受消费者喜爱。冷吃兔由于在加工过程中有大量油脂参与，属于油浸型食品，易被微生物污染，造成腐败。添加防腐剂是防止工业化生产食品腐败变质的常用措施，彭先杰等对引起冷吃兔腐败变质的微生物进行了分离和鉴定，发现沃氏葡萄球菌和枯草芽孢杆菌是导致冷吃兔腐败变质的特定腐败菌[3]。李琼等研究了软包装材料对自贡冷吃兔酸败的影响，发现温度是导致冷吃兔酸败的主要因素，并得出冷吃兔的最佳保藏温度为4 ℃，最佳包装材料为22丝PA/PET/RCPP复合膜[4]。舒梨等用副干酪乳杆菌发酵后的兔肉炒制的冷吃兔在口感、质地、风味、安全性和稳定性上都有较大提高[5]。

品种、性别、部位是影响兔肉腥味物质的重要因素。白小彦对比了不同品种的兔肉的腥味程度，发现不同品种的兔肉的腥味物质含量不同[6]。陈康等对不同性别兔肉的腥味物质进行SPME-GC-MS分析显示，雌兔的挥发性风味物质种类明显高于雄兔，但雄兔的腥味物质含量明显高于雌兔[7]。王珺等采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用相结合的方法，定性分析了不同部位兔肉的风味物质，发现兔肉的主体风味物质为醛类、醇类、酮类和烃类化合物，且不同部位的挥发性风味物质种类和含量存在明显差异[8]。谢跃杰等研究发现兔肉风味物质主要包括烯类、醇类、醛类、酯类、杂环类5类物质，且乙酸为兔肉挥发性风味物质的主要成分之一[9]。姜颖等研究认为卤代烷烃可能是构成兔肉腥味的重要成分，并且推断脂肪氧化酶(LOX)与兔肉腥味的形成密切相关[10-11]。白小彦等研究发现兔肉腥味的浓淡与兔肉中脂肪氧化酶(LOX)的含量呈正相关。

目前，没有关于防腐剂和高温杀菌对冷吃兔常温贮藏过程中风味影响的报道。本研究以新鲜兔肉为原料，加工成冷吃兔，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(HS-SPME-GC-MS)测定冷吃兔中的挥发性风味物质，并结合相对气味活度值(ROAV)法对冷吃兔中的挥发性风味物质进行分析，为工业化生产冷吃兔的常温贮藏保鲜提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜兔肉：购自成都十陵镇204菜市场。

1.2 仪器

BCD-452WDPF冷藏冰箱 青岛海尔集团；5977A-7890B气相色谱-质谱联用仪(含PAL3自动进样器) 美国安捷伦公司；赛多利斯万分之一天平 上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.3 冷吃兔加工方法

将新鲜兔肉洗净，切分为适宜大小的小块，加盐、葱、姜、白酒腌制20 min去腥，起锅热油，七成油温下入腌制好的兔肉丁，炒干兔肉水分，加入葱、姜、蒜、辣椒、花椒、盐、海椒面、生抽、老抽、白糖、酵母提取物增香调味，即为冷吃兔成品。防腐剂用量：脱氢乙酸钠(0.05 g/kg)、乳酸链球菌素(0.05 g/kg)、双乙酸钠(0.15 g/kg)、山梨酸钾(0.75 g/kg)。不同保鲜方式贮藏冷吃兔(A组：不加防腐剂不杀菌，B组：不加防腐剂杀菌，C组：加防腐剂不杀菌，D组：加防腐剂杀菌)。

1.4 GC-MS检测

称取3 g粉碎后的冷吃兔于15 mL的顶空瓶中密封，设置CTC自动进样器对样品的前处理条件：加热箱温度50 ℃，加热时间45 min，样品抽取时间20 min，解吸时间5 min。

色谱条件：HP-5MS UI色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；压力为32.0 kPa；流速为1.0 mL/min；载气为He，不分流进样；进样口温度设置为250 ℃；升温程序：起始温度为40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至70 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min升至120 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至160 ℃，保持1 min。

质谱条件：电子电离源(EI)；电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃；检测器电压为350 V；质量扫描范围(m/z) 为50～550。

定性：对化合物进行分析，将测定的数据在仪器中的NIST 14.L谱库中进行检索匹配，选择匹配度高于80%的物质。

定量：对总离子流色谱图采用峰面积归一化定量分析，得出各组分的相对含量。

1.5 特征挥发性风味物质的评价

为了评价各种挥发性物质对样品风味的影响程度，采用相对气味活度值(ROAV)法[12]，设定样品风味贡献程度最大的物质 ROAVs=100，样品中其他风味物质的ROAV值可通过下式计算：

式中：ROAVa为挥发性物质的相对气味活度值；C%a为各挥发性成分的相对含量；C%stan为对样品风味贡献程度最大的物质的相对含量；Tstan为对样品风味贡献程度最大的物质的感官阈值；Ta为各挥发性成分的感官阈值。

对于所有的风味物质，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV≤1的风味物质对样品风味起修饰作用；ROAV≥1的风味物质为冷吃兔中的主体风味物质，对冷吃兔中风味的贡献显著。ROAV值越大，说明此物质对样品冷吃兔中风味的贡献程度越大。

1.6 数据处理及分析

采用Microsoft Excel 2019进行数据统计，以各种风味物质作为变量，采用IBM SPSS Statistics 25.0进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 冷吃兔GC-MS分析

通过GC-MS结合固相微萃取，对A、B、C、D 4种不同保鲜方式样品冷吃兔贮藏的3个时间节点(0，14，28 d)进行了测定，结果见表1。

表1 4种冷吃兔中风味物质种类及含量

续 表

糖类与氨基酸发生美拉德反应以及不饱和脂肪酸的氧化降解是风味物质产生的主要途径[13]。4种不同保鲜方式冷吃兔中在3个时间节点共检测出63种挥发性风味物质，其中醇类22种、醛类9种、酯类9种、烷烃类7种、酮类6种、酸类5种、其他5种。

醇类物质主要来源于不饱和脂肪酸的生物降解[14]，由于其阈值较大，醇类物质相比于醛类物质对风味的影响程度更小。但是有一些不饱和醇类的阈值也很低，对样品的风味影响较大[15]。芳樟醇具有花香、木香，多来源于香料[16]。在冷吃兔常温储藏的过程中，A样品兔肉在3个时间节点醇类物质相对含量分别为21.42%、29.06%、27.65%；B样品兔肉在3个时间节点相对含量分别为22.36%、27.36%、22.22%；C样品兔肉在3个时间节点相对含量分别为24.4%、24.57%、26.70%；D样品兔肉在3个时间节点相对含量分别为25.34%、28.16%、28.26%，4个样品兔肉中醇类物质的差异不显著(p>0.05)。

醛类物质主要来源于不饱和脂肪酸的氧化，因其感觉阈值低，所以对样品风味的贡献程度很大。通过对比4种冷吃兔的醛类物质总相对含量，只有B与D相对含量差异较大(p=0.035<0.05)，其余组别两两对比相对含量差异均不大(p>0.05)。醛类物质中，主要是正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛。正己醛是一种较常见的挥发油，广泛存在于党参中[17]，通常赋予样品清香以及果香；苯乙醛被认为是通过Strecker降解苯丙氨酸而形成的，广泛存在水果、巧克力和蜂蜜中[18]。陈康等研究发现，母兔的挥发性风味物质是己醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛，这与本研究结果一致。

酯类物质是具有芳香型气味的挥发性化合物[19]，其主要是醇类物质与游离脂肪酸通过酯化反应生成的，酯类物质一般阈值较高，对冷吃兔的风味一般影响不大。酯类物质大多能够赋予肉类果香，除了部分内酯外，对样品风味贡献较小。

酮类物质主要来源于脂肪的氧化、微生物的氧化以及氨基酸的降解[20]，其呈味时间久，并且具有特殊的清香与花香[21]。酮类物质相对于互为同分异构体的醛类，阈值更高，对冷吃兔的风味起修饰作用[22]。通过对比4种冷吃兔样品酮类物质总相对含量，所有组别两两对比相对含量均无显著差异(p>0.05)。

酸类物质主要来源于脂肪酸甘油酯和磷脂酶解或加热氧化产生[23]。脱氢乙酸、山梨酸是冷吃兔中主要的酸类物质。有研究表明，γ辐射可以引起脱氢乙酸降解，辐解产物主要是庚烷-2，4，6-三酮[24]。

烷烃类物质主要来源于烷氧自由基的均裂，其中D-柠檬烯具有柑橘味道和柠檬香气[25]。因烷烃类物质阈值较高，对冷吃兔风味贡献也有一定的作用。

2.2 挥发性风味物质的ROAV分析

样品的风味主要是由含量以及感觉阈值共同决定的，通常含量高并且阈值小的物质对样品风味的贡献程度大。参考《化合物嗅觉阈值汇编》并且结合相对含量对各种挥发性风味物质进行ROAV值计算，结果以及编号见表2。

表2 冷吃兔的ROAV值Table 2 The ROAVs of spicy rabbit meat

3个时间节点的4种冷吃兔中共有23种挥发性风味物质，可通过查询阈值计算出对应的ROAV值，0.1≤ROAV<1的物质对样品风味有修饰作用；ROAV≥1的物质是样品的主体风味物质，对样品风味的贡献程度较大。

0 d冷吃兔中，桉叶油醇、芳樟醇、正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、月桂烯、D-柠檬烯、蒎烯为主体风味物质；顺-氧化芳樟醇、左旋香芹酮、茴香脑对0 d冷吃兔风味有一定的修饰作用。

14 d冷吃兔中，桉叶油醇、芳樟醇、正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、乙酸芳樟酯、月桂烯、D-柠檬烯、蒎烯为主体风味物质。紫苏醛、左旋香芹酮、茴香脑对14 d冷吃兔风味有一定的修饰作用。其中乙酸香叶酯在样品A、C(不杀菌组)中呈现修饰作用，在B、D(杀菌组)中对风味的贡献程度较大，它有清甜的水果香及甜润的玫瑰、薰衣草样香气[26]。反式-2,4-癸二烯醛的ROAV值在样品A、B、C中为100，它呈现出甜橙气息，并且具有脂肪的气息。芳樟醇在样品D中ROAV=100，在其他样品中ROAV值也偏大，它对此阶段的冷吃兔风味有很大的影响。

28 d冷吃兔中，桉叶油醇、芳樟醇、正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、月桂烯、D-柠檬烯、蒎烯为主体风味物质；苯乙醇、左旋香芹酮、茴香脑对此时间段冷吃兔风味起修饰作用。其中，芳樟醇、反式-2,4-癸二烯醛是两种对风味贡献最大的挥发性风味物质，它们分别呈现出铃兰香以及脂香、青香[27]。

综上，通过ROAV值得出冷吃兔中主体风味物质主要由中级醛、不饱和醇、乙酸酯、中级烯烃类组成。

2.3 主体风味物质的主成分分析

对ROAV≥1的挥发性风味物质采用主成分分析，提取特征值不小于1的主成分，3个时间节点的冷吃兔中主成分贡献率见表3。3个时间节点的冷吃兔样品前两个累计贡献率分别为82.70%、88.99%、76.10%。前两个主成分包含了绝大部分关键性风味物质。

表3 主成分特征值及累计贡献率Table 3 Principal component eigenvalues and cumulative contribution rates

续 表

提取4种冷吃兔中经主成分分析后所得到的载荷矩阵，结果见表4。

表4 载荷矩阵Table 4 Loading matrix

根据各种挥发性风味物质的特征向量，参照王志恒等的方法[28]，构建0，14，28 d冷吃兔中的主成分函数表达式。

0 d冷吃兔函数表达式：

F1=0.2711X1+0.2740X2-0.0134X3+0.1273X4-0.1957X5+0.0103X6+0.1937X7-0.2680X8-0.2332X9+0.2811X10+0.2680X11+0.2680X12+0.2603X13+0.2848X14+0.2845X15+0.2543X16+0.1273X17+0.0877X18+0.2236X19+0.2045X20-0.0014X21。

F2=0.0214X1-0.0540X2+0.4334X3-0.3794X4-0.0571X5+0.4129X6+0.2136X7-0.0856X8+0.1726X9+0.0361X10+0.0856X11+0.0856X12-0.1003X13-0.0129X14+0.0049X15-0.1949X16-0.3794X17-0.0642X18+0.1806X19+0.2894X20+0.2846X21。

14 d冷吃兔函数表达式：

F1=0.0999X1+0.2384X2+0.2510X3+0.2309X4+0.2332X5-0.2332X6+0.2219X7-0.1979X8-0.2177X9-0.2533X10+0.2015X11+0.2015X12+0.2401X13+0.2000X14+0.2394X15+0.2559X16+0.2530X17-0.1685X18+0.1355X19+0.2219X20+0.2162X21。

F2=-0.0205X1-0.1958X2+0.0903X3-0.2220X4-0.2231X5-0.1848X6+0.1559X7+0.2750X8+0.2021X9-0.0955X10+0.2766X11+0.2766X12-0.1758X13+0.3259X14+0.1884X15+0.0635X16-0.0509X17-0.2577X18-0.4178X19+0.2278X20-0.2115X21。

28 d冷吃兔函数表达式：

F1=0.3155X1+0.3068X2+0.2176X3+0.2734X4-0.0208X5-0.0217X6+0.1342X7-0.1540X8-0.1245X9+0.0230X10+0.0208X11-0.2114X12+0.3129X13+0.2983X14+0.2153X15+0.2857X16+0.3055X17+0.0669X18+0.3000X19+0.2701X20-0.0694X21+0.0006X22。

F2=-0.0112X1-0.0822X2-0.0785X3+0.1871X4+0.3667X5+0.3686X6+0.2979X7+0.3165X8+0.0796X9+0.0837X10-0.3667X11+0.1480X12+0.0260X13+0.1034X14-0.2432X15+0.0167X16-0.0889X17+0.2626X18+0.0391X19+0.1990X20-0.2626X21-0.2551X22。

函数表达式中Fi(i=1,2)为主成分，X1～X22分别为各种挥发性风味物质所对应的值。以每一个主成分的贡献率与提取的主成分累计贡献率比值作为系数得到综合评价模型：

0 d冷吃兔综合评价模型：F=0.710X1+0.290X2，

14 d冷吃兔综合评价模型：F=0.806X1+0.194X2，

28 d冷吃兔综合评价模型：F=0.568X1+0.432X2。

根据模型计算得到4种冷吃兔在3个时间节点的主成分综合得分表，见表5。

表5 冷吃兔中综合因子得分及排序Table 5 Comprehensive factor score and sequence of spicy rabbit meat

综合4种不同处理方式冷吃兔在3个时间节点的得分，计算4种冷吃兔得分的相关性系数。A和B的相关系数为0.953，A和C的相关系数为0.790，A和D的相关系数为0.889。

3 结论

采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用对4种不同保鲜方式的冷吃兔中挥发性风味物质进行鉴定。4种冷吃兔中一共鉴定到63种挥发性风味物质，两两对比，总相对含量基本无显著性差异(p>0.05)。结合相对气味活度值(ROAV)，筛选出ROAV≥1的23种关键性风味物质，其中，芳樟醇、D-柠檬烯、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛是对冷吃兔风味贡献最大的风味物质。通过计算每种冷吃兔在各时间节点的主成分综合得分，推测添加防腐剂以及高温杀菌对冷吃兔中挥发性风味物质的含量以及种类影响不大。