同位素稀释-液相色谱串联质谱法测定渔用饲料中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留

杨开智，索纹纹，梁 丹，刘伶俐，万译文*

（1.常德市畜牧水产事务中心，湖南常德 415000；2.湖南省水产科学研究所，湖南长沙 410153）

氟苯尼考（Florfenicol，FF）又名氟甲砜霉素，是一种新型化学合成酰胺醇类抗菌药，对革兰氏阴性菌、阳性菌及支原体有很强的活性，具有很强的抗菌能力（冯民等，2013），因其价格低廉、疗效好，曾被广泛用于动物的疾病防治。氟苯尼考作为氯霉素的替代品被广泛用于水产品养殖中，水产品中氟苯尼考残留问题也引起消费者的担忧，氟苯尼考经代谢后形成多种代谢产物，但大部分以氟苯尼考和氟苯尼考胺的形式存在，GB31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定，在水产品中，氟苯尼考最大残留限量（氟苯尼考与氟苯尼考胺之和）为1000μg/kg（仲伶俐等，2021；李雅宁等，2020）。

饲料一般是兽药添加的主要载体，对渔用饲料中，氟苯尼考及氟苯尼考胺的检测能从源头上进行有效控制。目前氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺常用的检测方法主要有4种，分别为酶联免疫法（皮江一等，2021；刘智宏等，2010）、气相色谱质谱法（乔青青等，2021）、高效液相色谱法（马文瑾等，2020；刁志祥等，2019）和液相色谱串联质谱法（陈国等，2019；FEDENIUK等，2015；陈涛等，2020）。目前国内对氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的研究主要涉及在鸡蛋（曾勇等，2019）、鸡肉（张凤清等，2010）、猪肉（宋菲等，2021；陶晰晨等，2014）和水产品上（邵会等，2015；刘正才等，2015），对饲料中氟苯尼考和氟苯尼考胺同时测定的研究不多，因此，建立一种快速、简单、同时测定渔用饲料中氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法具有重要意义，以便对水产品食用饲料进行有效监控。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂超高效液相色谱串联质谱仪（配电喷雾离子源），AB Sciex公司；高速冷冻离心机，德国Sigma公司；漩涡混匀仪，德国IKA公司；超声波清洗器，昆山超声波仪器厂；24孔氮吹仪，美国organomation公司；平行旋转蒸发仪，瑞士Buchi（布奇）公司；精密电子天平，梅特勒—托利多称重设备系统有限公司。

氟苯尼考及氟苯尼考胺标准品，纯度均为99.5%以上（德国Dr.Ehrenstorfer 公司）；氘代氯霉素，CAP-D5（德国Dr.Ehrenstorfer 公司）；氘代氟苯尼考胺，FFA-D3（天津阿尔塔科技有限公司）；乙酸乙酯、甲醇、正己烷均为色谱纯（德国默克公司）；氨水，分析纯（四川西陇化工有限公司）；固相萃取小柱（美国waters公司）；无水硫酸钠，于450℃下灼烧6h后储存于干燥器中备用；实验室用水均为屈臣氏蒸馏水。

1.2 样品前处理准确称取粉碎后的饲料样品2.0 g（精确至0.01 g）至50 mL离心管中，加入0.05 mL CAP-D5和FFA-D3内标溶液（浓度均为100 ng/mL），旋涡混匀，加入0.5 mL氨水和10 mL乙酸乙酯，涡旋混匀后超声提取10 min，取出后于离心机8000 r/min离心5 min，将上清液转移至加入5 g无水硫酸钠的25 mL带塞离心管中，样品残渣继续加入0.5 mL氨水和10 mL乙酸乙酯后离心，合并2次提取液。取10 mL上清液于45℃水浴中旋转蒸干。加入4 mL水溶解残渣，混匀后待净化。

将上述溶解液转移至混合阳离子固相萃取小柱中（MCX，500 mg/6 mL），使用前依次用 5 mL甲醇和5 mL水活化，用8 mL水淋洗后抽干，用5 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液。在45℃水浴中氮吹至干，用1 mL甲醇-水（1：9，V：V）定容混匀后过0.2μm滤膜，上机待测。

1.3 色谱条件色谱柱为Capcell Pak ADME（100 mm×2.1 mm，2.7μm）；柱温为40℃，进样量为5μL，流动相A为0.05% 甲 酸 -2.0 mmol/L甲酸铵溶液；B为甲醇；采用液相梯度洗脱 程 序 为：0～ 1 min，95%A；1～ 3 min，95%A～ 60%A；3～ 4 min，60%A～ 30%A；3～ 4 min，30% A ～ 10%A；4～ 4.5 min，10%A～95%A，保持3 min。流速为300μL/min。

1.4 质谱条件采用电喷雾离子源（ESI）；正负离子切换扫描；扫描方式为多反应检测模式（MRM）；喷 雾 电 压 为 ESI+（4500V）、ESI-（-3500V）；离子源温度（TEM）为350℃；射入电压（EP）为 10 V ；离子源气（GS）为50 psi，其他离子源参数见下表1。

表1 4种目标物的MRM采集参数

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择及优化

2.1.1 提取溶液的选择 国内对氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的提取采用乙腈和乙酸乙酯的较多（陈涛等，2020）。本文比较了乙酸乙酯-氨水和乙腈两种提取液，实验中发现极性强的乙腈提取效率好，但提取液含有大量脂肪、色素等大分子杂质，提取液较浑浊，在净化处理时容易堵塞固相萃取柱，且在浓缩后，瓶壁上有白色的脂肪等难以溶解的凝结物。氟苯尼考胺属于碱性化合物，更易溶解于碱性溶液中，氨化后采用乙酸乙酯提取后提取液更澄清，且旋蒸过程中浓缩速度比乙腈快，因此，采用氨水碱化的乙酸乙酯进行提取。

2.1.2 净化方式及固相萃取柱的选择 本文采用固相萃取的方式来进行净化，研究比较了中性氧化铝柱、HLB柱、C18柱和混合阳离子交换柱（MCX）对渔用饲料中氟苯尼考及氟苯尼考胺的净化效果和回收率。结果表明，采用HLB固相萃取柱对氟苯尼考胺保留效果较差，回收率只有26.2%，MCX柱对氟苯尼考胺的净化效果最好，回收率达到90%以上，综合考虑，本文采用MCX柱对提取液进行净化。

图1 不同SPE柱对氟苯尼考及氟苯尼考胺净化回收率的影响

2.2 色谱条件的选择及优化试验比较了乙腈-水、甲醇-水和甲醇-2.0 mmol/L甲酸铵溶液（含0.05%甲酸）3种不同的流动相。乙腈洗脱能力强，氟苯尼考胺属于极性药物，出峰时间极短，大概在1 min之内出峰，不利于氟苯尼考胺的保留。当采用甲醇-水作为流动相时，氟苯尼考灵敏度和峰形较好，但氟苯尼考胺峰形不够尖锐，保留不稳定。在水相中加入挥发性电解质甲酸铵并加入0.05%甲酸控制流动相pH，采用合适的梯度洗脱程序，氟苯尼考及氟苯尼考胺峰形尖锐且对称性好，增大了两者离子峰的峰强度。因此，本文采用甲醇-2.0 mmol/L甲酸铵溶液（含0.05%甲酸）为流动相梯度洗脱。如图2所示。

图2 空白饲料中5.0μg/kg氟苯尼考及氟苯尼考胺加标样品离子色谱图

2.3 质谱条件的选择及优化采用同位素稀释法进行定量分析，选用氘代氯霉素作为氟苯尼考内标物，氟苯尼考及氘代氯霉素在ESI负离子模式下进行扫描，形成准分子离子[M-H]-，氟苯尼考胺及氘代氟苯尼考胺在ESI正离子模式下进行扫描，形成准分子离子[M+H]+。在正负离子不同模式下，通过对碰撞能量、去簇电压等质谱参数进行优化，在二级质谱扫描模式下选取离子丰度强、选择干扰小的子离子作为定量离子，次强的子离子作为定性离子来满足药物分析确诊的要求。经过优化后的各化合物质谱参数见表1。

2.4 方法线性范围、检出限及定量限吸取适量的混合标准中间液（1.0 mg/L），用经过“1.3 样品前处理”复溶后的空白基质溶液稀释，制得基质标准曲线浓度为 5、10、20、50、100、200 ng/mL 的基质标准工作液。通过空白饲料样品标准加入方法处理后确定方法检出限和定量限，方法检出限的信噪比大于等于3，方法定量限的信噪比大于等于10，结果见表2。

表2 线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 方法回收率与精密度在市场中购买3种不同品牌的渔用饲料，采取标准添加方法，在空白样品中加入低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，3个添加水平均做6个平行，同时做对应的样品空白和试剂空白，按1.3节所述条件进行加标回收率实验，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表3。由表3可知，该方法回收率和精密度满足分析方法确诊要求，重现性好，适合渔用饲料中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留的测定。

表3 氟苯尼考及氟苯尼考胺在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差（RSDs，n=6）

3 结论

本文通过对前处理条件、色谱条件及质谱条件进行优化，建立了液相色谱串联质谱法来测定渔用饲料中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量。方法采用同位素稀释添加和基质标曲相结合的方式抑制基质效应对氟苯尼考胺的干扰，提高了方法的准确性和重复性。通过方法学验证，该方法可全面、准确地监测饲料中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留，为政府加强对饲料违规使用兽药问题的监管提供技术支撑。