响应面法优化重组谷氨酸棒杆菌G-BC产脂肪酸的培养条件

杨 青，孙子羽，满都拉，王 佳，刘 瑾，金晶晶，陈忠军

(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，呼和浩特 010018)

食用油的主要成分为脂肪酸甘油三酯，脂肪酸是生物体内必需的有机物之一[1]，是机体的重要供能物质。另外，脂肪酸作为一种重要的平台化合物，可进一步合成高能比生物燃料及高附加值油脂化学品[2-4]。目前，微生物法合成脂肪酸因具有代谢产物易分解、脂肪酸含量高等优点，而被越来越多地用来生产特种脂肪酸，如EPA和DHA[5-6]等。

目前，用于脂肪酸合成的微生物主要有酵母[7-8]、霉菌[9]、细菌[10-12]和藻类[13]等。但这些微生物合成脂肪酸的机制研究尚不成熟，因此探索高效环保的生物合成路线是今后脂肪酸合成的发展趋势[14]。谷氨酸棒杆菌作为一种重要的工业模式菌株，具有底物范围广、遗传背景清楚、易于工程调控、可高密度发酵等特点，已经成为微生物催化合成化学品和燃料的理想受体菌[15-16]，且其细胞壁不含脂多糖，有利于产物脂肪酸的分离纯化。但对谷氨酸棒杆菌的脂肪酸合成及转运调控机制研究尚不深入。

脂肪酸的合成主要包括3个过程：第一个过程是从葡萄糖出发，经糖酵解作用和三羧酸循环，为机体脂肪酸合成提供底物乙酰辅酶A；第二个过程是苹果酸酶催化苹果酸脱羧转化生成丙酮酸，并释放NADPH，是脂肪酸合成的主要动力来源；第三个过程是经脂肪酸从头合成，乙酰辅酶A在脂肪酸合成酶系(FAS)的催化下转化生成脂酰辅酶A，脂酰辅酶A在硫酯酶TesA的水解作用下，释放出游离脂肪酸[17]。乙酰辅酶A羧化酶α亚基是编码脂肪酸合成途径中乙酰辅酶A羧化酶的关键基因之一[18]，但目前对于该基因的研究较少。本实验室在前期的研究工作中已经构建了乙酰辅酶A羧化酶α亚基(accBC)的表达菌株重组谷氨酸棒杆菌G-BC，本研究通过响应面法优化该重组菌株产脂肪酸的培养条件，通过对比其与原始菌株脂肪酸产量的差异确定accBC基因对脂肪酸合成的影响，从而为后续通过基因优化构建脂肪酸高产菌株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种

含pXMJ19-accBC重组质粒的重组谷氨酸棒杆菌菌株G-BC，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Corynebacteriumglutamicum)，均由本实验室构建和保存。

1.1.2 培养基及试剂

LB培养基：酵母提取粉(5 g/L)、胰蛋白胨(10 g/L)、氯化钠(10 g/L)，必要时添加25 ng/μL的氯霉素抗生素，购自广东环凯微生物科技有限公司。十一烷酸甲酯，购自美国Sigma公司。

1.1.3 仪器与设备

H3018DR高速冷冻离心机，上海知信实验仪器技术有限公司；LGJ-18S 冷冻干燥机，河南兄弟仪器设备有限公司；Clams680 气相色谱仪，珀金埃尔默仪器有限公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度计，美国 Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 试验方法

1.2.1 重组谷氨酸棒杆菌G-BC的培养

取重组谷氨酸棒杆菌G-BC甘油保藏菌，在含氯霉素的抗性平板上划线培养。提取单菌落于含25 ng/μL氯霉素的LB液体培养基中，30℃、180 r/min条件下过夜培养。取上述培养液作为种子培养液，按照4%的接种量转接至LB液体培养基(含氯霉素25 ng/μL)中，30℃振荡培养至OD600约为0.6，分别添加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至一定终浓度，于一定温度下诱导培养一定时间，离心收集菌体，冷冻干燥，测定菌体中脂肪酸产量。

1.2.2 脂肪酸产量的测定

采用气相色谱内标(十一烷酸甲酯)法测定菌体的脂肪酸产量。

甲酯化：称取约0.12 g菌粉，加入4 mL正己烷-异丙醇(体积比3∶2)溶液、2 mL6.25%的Na2SO4溶液，室温、5 300 r/min下离心20 min。取上清液于20 mL水解管中，用氮气吹干。加入2 mL 2% 氢氧化钠甲醇溶液，在50℃水浴15 min，冷却后加入2 mL 10%盐酸甲醇溶液，在80℃水浴1.5 h。冷却到室温，加入3 mL超纯水和6 mL正己烷，振荡，静置或离心分层。吸取上层液体(尽量吸净)，定容至10 mL，加无水Na2SO4干燥后，待气相色谱分析。

色谱条件：DB-WAX石英毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱箱升温程序为起始温度120℃，保持5 min，以5℃/min的速率升到225℃，保持1 min，以8℃/min的速率升到240℃，保持5 min；氢火焰离子化检测器(FID)温度260℃；进样口汽化温度260℃；载气(N2)流速 1.0 mL/min；氢气流速45 mL/min；空气流速450 mL/min；进样量1.0 μL。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 诱导剂浓度对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响

在培养温度30℃、培养时间20 h条件下对重组谷氨酸棒杆菌G-BC进行培养，分析不同诱导剂浓度(0.5、1、1.5、2、2.5 mmol/L)对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响，结果见图1。

图1 诱导剂浓度对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响

由图1可知，在0.5～1 mmol/L范围内，随着诱导剂浓度的增加，脂肪酸产量提高，诱导剂浓度为1 mmol/L时脂肪酸产量达到最高，随着诱导剂浓度的继续提高，脂肪酸产量大幅度降低。诱导剂浓度的提高并不对应着脂肪酸产量的提高，这是由于IPTG对微生物细胞有一定的毒性作用，IPTG终浓度过高和过低均不利于脂肪酸的积累。因此，选择诱导剂浓度为1 mmol/L。

2.1.2 培养时间对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响

在诱导剂浓度1 mmol/L、培养温度 30℃条件下对重组谷氨酸棒杆菌G-BC进行培养，分析不同培养时间(12、16、20、24、28 h)对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响，结果见图2。

图2 培养时间对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响

由图2可知，随着培养时间的延长脂肪酸产量呈线性增加，在20 h时达到最高，随后略微降低。这是由于在微生物生长的稳定期后期脂肪酸作为一种营养物质而被消耗。因此，选择培养时间为20 h。

2.1.3 培养温度对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响

在诱导剂浓度1 mmol/L、培养时间20 h条件下对重组谷氨酸棒杆菌G-BC进行培养，分析不同培养温度(26、28、30、32、34℃)对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响，结果见图3。

图3 培养温度对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响

温度是影响微生物生长最重要的因素之一，在微生物的代谢过程中也会影响相关酶的活力，从而改变功能酶的作用，影响脂肪酸的合成。从图3可知，培养温度升高，脂肪酸产量增加，在培养温度为32℃时脂肪酸产量最大，之后脂肪酸产量直线下降，这可能是由于过高的温度降低了酶的活性，最终降低了脂肪酸产量。因此，选择培养温度为32℃。

2.2 响应面试验

根据单因素试验结果，以诱导剂浓度(A)、培养时间(B)、培养温度(C)为自变量，脂肪酸产量(Y)为响应值，采用Box-Behnken法进行三因素三水平的响应面试验设计，对重组谷氨酸棒杆菌G-BC产脂肪酸的培养条件进行优化。响应面试验因素及水平见表1，响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

利用Design-Expert 8.0软件，对表2中3个因素进行二次多项回归拟合，得到多元二次回归方程：Y=33.68+1.05A-0.19B+0.029C+0.063AB+0.29AC+0.27BC-3.29A2-1.99B2-2.03C2。对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析

通过响应面模型优化，得到重组谷氨酸棒杆菌G-BC产脂肪酸的最优培养条件为诱导剂浓度1.04 mmol/L、培养时间19.83 h、培养温度32.03℃，在此条件下模型预测脂肪酸产量为33.76 mg/g。为了便于操作，修正培养条件为诱导剂浓度1 mmol/L、培养时间20 h、培养温度32℃，在此条件下进行3组平行验证试验，平均脂肪酸产量可达34.56 mg/g，与模型的预测值接近，说明该模型可靠。

前期试验得到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的脂肪酸产量为12.88 mg/g，而在最优培养条件下重组谷氨酸棒杆菌G-BC的脂肪酸产量为34.56 mg/g，比原始菌株增加了1.68倍，说明accBC基因的引入能够增加谷氨酸棒杆菌脂肪酸产量。

3 结 论

本研究探究了诱导剂浓度、培养时间、培养温度对于重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响，然后通过响应面法得到重组谷氨酸棒杆菌产脂肪酸的最佳培养条件为诱导剂IPTG浓度1 mmol/L、培养时间20 h、培养温度32℃，在此条件下重组菌株的脂肪酸产量为34.56 mg/g(以菌体干质量计)，比原始菌株提高了1.68倍。说明乙酰辅酶A羧化酶α亚基基因对于谷氨酸棒杆菌中脂肪酸的合成起到促进作用。本研究为后续通过共表达脂肪酸合成途径中的多基因(如脂肪酸合酶、硫酯酶等)来构建脂肪酸高产菌株提供了理论依据。