内部沸腾法提取骨碎补多糖及其抗氧化活性研究

梁家灿，文慧香，梁云贞 (.昆明学院农学与生命科学学院，云南昆明 65000；.南华大学化学化工学院，湖南衡阳 4000；3.广西民族师范学院化学与生物工程学院，广西崇左 53500)

骨碎补(Moore ex Bak.)是一种比较常用的中药，具有补肾、强骨、止痛等功效，用于治疗耳鸣耳聋、牙齿松动、筋骨伤折、肾虚腰痛、跌扑闪挫等症状。市场上比较常见的主流产品是水龙骨科的植物槲蕨((Kunez)J.sm.)的干燥根茎。骨碎补研究较多的活性成分是黄酮类化合物和多糖等。多糖类物质作为植物中主要的活性成分之一，在促进动物生长发育以及作为抗氧化剂等方面扮演着十分重要的角色。

内部沸腾法具有省时、高效、反应条件易达成等特点，因此相对于传统水提法等，在植物有机成分的提取方面具有十分明显的优势。该研究以中药骨碎补作为原料，采用内部沸腾法对其体内多糖进行提取，通过单因素试验和正交试验确定最佳的内部沸腾提取方案并在后续试验中测定骨碎补多糖的抗羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的氧化活性。

1 材料与方法

骨碎补样品，广西崇左市龙州县；98%硫酸、苯酚、无水乙醇，均为分析纯，购于广东光华科技股份有限公司；三氯乙酸、正丁醇、过氧化氢，均为分析纯，购于成都市新都区木兰镇工业开发区；水杨酸(≥99.5%)、FeSO·7HO(99.0%～101.0%)，购于天津市光复精细化工研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(≥97%)，购于上海蓝季科技发展有限公司。

DSY-9002高速万能粉碎机(永康市九顺莹商贸有限公司)；V-1100D可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；AUW220D电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；HZ-2A恒温水浴锅(南京南大万和科技有限公司)；80-2离心沉淀机(金坛市医疗仪器厂)。

骨碎补样品处理。将采回的槲蕨根茎洗净后于电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，粉碎，过80目筛。将过筛后的槲蕨根茎粉末用石油醚脱色风干后即为所需的骨碎补样品。

葡萄糖标准曲线的绘制。参考郭燕菲等的方法绘制标准曲线，准确配制浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。取6支试管依次准确量入0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的上述葡萄糖标准品溶液，补水至2 mL。用苯酚-浓硫酸法在490 nm处测定其吸光度，以葡萄糖含量(mg)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，得到回归方程为=738+0026(=0.999 1)。

多糖提取。准确称量0.250 g骨碎补样品，加入2.5 mL乙醇，室温下解吸，加入热蒸馏水10 mL等温水浴提取后放入离心机中3 000 r/min离心30 min，取上清液测其多糖含量，根据公式(1)计算骨碎补多糖提取率。

提取率=××(××1 000)×100%

(1)

式中，为骨碎补样品质量(g)；为骨碎补样品提取液定容体积(mL)；为稀释倍数；为骨碎补多糖提取液测得吸光度代入葡萄糖标准曲线线性回归方程计算得出的骨碎补多糖质量(mg)；为用于测定吸光度所移取的骨碎补多糖提取液(mL)。

单因素试验。以乙醇解吸液体积分数为40%、解吸时间为15 min、水浴提取时间为4 min、水浴提取温度为50 ℃分别作为基础，分别固定其他3个影响因素，按照“..”方法对骨碎补多糖进行内部沸腾提取并计算比较多糖的提取率，研究不同乙醇解吸液体积分数、解吸时间、水浴提取温度、水浴提取时间对多糖提取率的影响。

正交试验。根据单因素试验结果，将影响提取率的4个影响因子设计成4因素3水平的正交表，再根据其排列组合进行验证试验。通过比较提取率和正交方差确定最佳的内部沸腾提取骨碎补多糖的方案。

抗氧化活性试验。

DPPH自由基清除能力的测定。取5支试管，分别加入2 mL“..”提取得到的不同浓度的骨碎补多糖溶液，在每支试管中各加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，摇匀后置于室温下避光静置30 min，以无水乙醇作为空白对照，在517 nm下测定反应体系的吸光度，记为；取2 mL不同浓度骨碎补多糖溶液和2 mL无水乙醇空白对照溶液的混合液测定其吸光度，记为；测定2 mL无水乙醇空白对照溶液和0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL的混合液的吸光度，记为。以相同浓度的溶液作为阳性对照，其清除率计算公式如下：

清除率=[1-(-)/y]×100%

(2)

羟基自由基清除能力的测定。取5支试管，分别加入2 mL“..”提取得到的不同浓度的骨碎补多糖溶液，再加入2 mL的6 mmol/L的FeSO溶液和6 mmol/L的 HO溶液2 mL，使其充分混匀，静置反应10 min，再加入2 mL 的6 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液，使其充分混匀再次静置反应30 min，以蒸馏水作为空白对照溶液，在510 nm下测定吸光度，记为；然后以蒸馏水代替骨碎补多糖溶液重复上述步骤，在510 nm下可见分光光度计测定其吸光度，记为；以2 mL 蒸馏水代替HO溶液再次重复上述步骤，在510 nm下测定其吸光度，记为；以相同浓度的V溶液作为阳性对照，羟基自由基清除率的计算公式如下：

清除率=[1-(-)/l ]×100%

(3)

2 结果与分析

乙醇解吸液体积分数对多糖提取率的影响。从图1可以看出，当乙醇解吸液体积分数为40%时提取率达到了峰值(5.44%)。因为内部沸腾法的特性，浸润骨碎补样品的乙醇体积分数较低时，骨碎补将吸收乙醇后在后续加入热蒸馏水并水浴提取时内部不能形成有效的沸腾，不利于多糖的提取。而乙醇解吸液体积分数过高可能会导致某些糖类物质不易溶解，故提取率反而下降。

图1 不同乙醇解吸液体积分数对骨碎补多糖提取率的影响Fig.1 Effects of different ethanol desorption liquid fractions on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

水浴提取时间对多糖提取率的影响。从图2可以看出，当水浴提取时间为4 min时提取率达到了峰值(6.61%)。随着提取时间的延长会使得其他非糖物质也大量溶解于乙醇解吸液中，使得随着水浴提取时间的延长骨碎补多糖的提取率反而下降。

图2 不同水浴提取时间对骨碎补多糖提取率的影响Fig.2 Effect of different water-bath extraction time on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

解吸时间对多糖提取率的影响。从图3可以看出，解吸时间为15 min时提取率达到了峰值(9.32%)。乙醇解吸液与骨碎补样品之间的作用时间短会导致乙醇解吸液未能完全渗透细胞壁，将骨碎补样品内部多糖成分充分解吸,从而使骨碎补多糖提取率未能达到峰值，解吸时间过长非糖物质也得到了充分的解吸，影响多糖的提取率。

图3 不同解吸时间对骨碎补多糖提取率的影响Fig.3 Effect of different desorption time on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

水浴提取温度对多糖提取率的影响。从图4可以看出，水浴提取温度在80 ℃时骨碎补多糖提取率达到了峰值(10.35%)。水浴温度过高时虽然反应足够剧烈，但是高温会加速乙醇解吸液的挥发，并且过高的温度会破坏骨碎补内部的活性成分，故水浴提取温度过高骨碎补多糖的提取率反而降低。

图4 不同水浴提取温度对骨碎补多糖提取率的影响Fig.4 Effect of different water-bath extraction temperatures on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

从正交试验结果的极差(表1)可以看出，各因素对骨碎补多糖提取的影响从大到小依次为水浴提取温度(C)>水浴提取时间(D)>解吸时间(B)>乙醇解吸液体积分数(A)。细胞内外温度差是内部沸腾法提取骨碎补多糖的关键，温度过低则产生压力不足，温度过高则会加速乙醇的挥发影响多糖提取率。内部沸腾法提取骨碎补多糖的最佳提取条件为ABCD，即乙醇解吸液体积分数为50%，解吸时间为15 min，水浴提取温度为80 ℃，水浴提取时间为4 min。

表1 内部沸腾法提取骨碎补多糖的正交试验结果Table 1 Orthogonal test results of extraction of Rhizoma Drynariae polysaccharide by internal boiling method

根据得出的最佳提取条件进行3次重复试验，通过计算得出骨碎补多糖平均提取率为10.90%，相对标准偏差(RSD)为1.04%。据此可以验证正交试验得出的最佳提取条件的稳定性和可重复性。所以可以确定内部沸腾法提取骨碎补多糖的最佳提取条件为ABCD。

DPPH自由基清除能力的测定。从图5可以看出，骨碎补多糖具有一定的DPPH自由基清除能力，其对DPPH自由基的清除率与多糖浓度相关。在多糖浓度为0.5%时，骨碎补多糖对DPPH自由基的清除率达到74.8%，而作为阳性对照的V溶液对DPPH自由基的清除率达到了82.1%，仅相差7.3百分点。

图5 骨碎补多糖对DPPH自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of Rhizoma Drynariae polysaccharide on DPPH free radicals

羟基自由基清除能力的测定。从图6可以看出，相比V，骨碎补多糖对羟基自由基有良好的清除能力，当多糖浓度为0.5%时，骨碎补多糖对羟基自由基的清除率达到78.3%，而作为参照标准的V对羟基自由基的清除率为84.1%，仅相差5.8百分点。表明骨碎补多糖浓度与清除率之间有较好的量效关系。

图6 骨碎补多糖对羟基自由基的清除能力Fig.6 The scavenging ability of Drynaria polysaccharide on hydroxyl radicals

3 结论与讨论

该研究通过单因素试验和正交试验确定了内部沸腾提取骨碎补多糖的最佳提取方案为乙醇解吸液体积分数50%、解吸时间15 min、水浴提取温度80 ℃、水浴提取时间4 min。并对其抗羟基自由基和DPPH自由基能力进行研究，结果显示骨碎补多糖对羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别达到了78.3%和74.8%，表明骨碎补多糖有良好的抗氧化能力。骨碎补作为一种传统中药材，在人体免疫疾病上有不同程度的作用。该试验的结果显示，骨碎补中多糖成分含量较高是其发挥药用价值的基础。通过多骨碎补多糖提取方法和含量的研究可以更科学地对中药进行使用。