高等植物氢化酶活性研究进展

宋怡菲， 谢飞， 马晨， 马雪梅

北京工业大学环境与生命学部，北京 100124

氢化酶是一类金属酶，它能够催化一个简单的可逆反应，即氢气的氧化或质子的还原。氢化酶活性已被证实广泛分布于一些原核生物与衣藻等低等真核生物中，且主要存在于厌氧微生物体内。高等植物的产氢现象也已经在多个研究中得到了报道，如在大麦［1］、拟南芥［2］等植物种子萌发阶段的产氢现象［3］，以及豌豆和菠菜叶绿体的产氢现象［4］。除了植物的产氢能力，另一方面，外加氢干预或内源氢气的产生对植物生长也会产生显著影响。一些研究表明，H2可能增强植物对生物或非生物胁迫的耐受性［5-9］，并改善蔬菜、鲜花和水果的品质［10-13］。植物生长代谢与氢气的密切关系暗示了植物体内氢化酶活性存在的可能性，然而，H2在不同植物中引发生理影响的机制及其信号级联反应目前尚不清楚。研究已经证实植物叶绿体的产氢活性，但鉴于多种植物种子萌发时能够产氢的现象，结合氢化酶在进化上与线粒体复合物Ⅰ的同源性［14-15］，可以推测植物产氢能力可能是由于其线粒体中存在氢化酶活性。氢化酶体的产氢特性及其与线粒体在进化上的密切关系也提示氢气的作用目标可能在线粒体内。

近年来，随着人口增长、气候变化、自然灾害、环境污染和食品安全等问题的加剧，全球农业面临着重大挑战。氢分子对作物生长产生良性影响的众多研究成果表明，氢农业作为氢气生物学的一种新兴应用，可能有助于缓解农业发展中的诸多挑战。因此，高等植物体内氢化酶活性的研究作为氢农业的理论基础，值得我们进一步探究。同时，若高等植物线粒体具有氢化酶活性的假说最终能被证实且线粒体中氢化酶的具体定位与其催化特性可以被明确，将有助于理解真核生物的进化过程，同时也会对高等植物线粒体的功能有全新的认识。

1 氢化酶简介

氢化酶是一类金属酶，它能够催化一个简单的可逆反应，即氢气的氧化或质子的还原：H2（⇋H++H-）⇋ 2H++2e-［16］。根据氢化酶催化的特性，可将其分为吸氢酶、放氢酶和双向氢化酶等类型。根据活性中心所含金属组成不同，氢化酶可分为三类，即镍铁（［Ni-Fe］）、铁铁（［Fe-Fe］）和唯铁（［Fe］）氢化酶［17］。

［Ni-Fe］氢化酶是分布最广泛的氢化酶，大多数［Ni-Fe］氢化酶都是吸氢型的，主要存在于细菌和古细菌中。虽然［Ni-Fe］氢化酶可以是多聚体，但其至少包含一个异源二聚体核心成分，其中包括一个大的α亚基（约60 kD）和一个小的β亚基（约30 kD），含有铁硫簇（Fe-S），活性中心铁原子被小的无机配体（CO和CN-）连接。［Ni-Fe］氢化酶根据系统发育和生理功能可分为5个亚组。这类氢化酶最常见的生理特性是对氧气耐受和对氢气的低亲和力［16］。

［Fe-Fe］氢化酶主要存在于一些厌氧原核生物和绿藻中。［Fe-Fe］氢化酶可以是单体或二聚酶、三聚酶或四聚酶，含有两个铁原子的活性中心（称为H簇）以及Fe-S簇。［Fe-Fe］氢化酶严格厌氧，活性部位会因氧气暴露而发生变性。大多数［Fe-Fe］氢化酶只产生氢气，但也有少数具有吸氢酶活性。［Fe-Fe］氢化酶是目前唯一已被证实的在真核生物中存在的氢化酶类型，在绿藻中该酶为单一亚基，定位于细胞的叶绿体内［16］。

［Fe］氢化酶由2个38 kD的同型二聚体组成，催化中心有1个Fe原子。与［Ni-Fe］和［Fe-Fe］氢化酶相比，［Fe］氢化酶不含Fe-S簇。该酶目前只在古细菌中发现，且不被氧气灭活［16］。

氢化酶的催化中心非常复杂，通常需要一个组装成熟过程。例如，［Fe-Fe］氢化酶催化中心核心结构Fe-S簇或H簇需要3种成熟酶蛋白HydE、HydF和HydG的协助参与组装［18］。在含有氢化酶的微生物，尤其是一些厌氧细菌中，产生或消耗氢气的能力与其代谢和生物学功能密切相关，在这些微生物中氢气能作为一个可扩散的电子载体来传递电子。

2 不同生物中的氢化酶活性

2.1 原核生物的氢化酶活性

氢化酶相关研究最早起源于对一些原核生物氢代谢现象的研究。1931年，研究人员在微生物体内发现了一种能够将甲酸分解，同时引起氢气产生的物质，并将其命名为氢化酶［19］。1974年，Chen等［20］从巴氏梭菌W5中分离纯化出了可溶性氢化酶。后来，在几乎所有的固氮型蓝藻中都发现了具有消耗H2的氢化酶活性，且在非固氮型蓝藻中存在双向氢化酶活性［21］。

2.2 低等真核生物的氢化酶活性

低等植物中的氢代谢现象多发现于藻类中，且以在莱茵衣藻中的研究居多，如Happe等［22-23］在1993年和1994年的研究中发现，单细胞绿藻莱茵衣藻具有一种高活性的［Fe-Fe］氢化酶HydA1，且其定位于叶绿体中。后续研究发现，当衣藻细胞处于硫元素缺乏的环境时，在数天的光依赖反应中可产生大量H2［24］。另一项研究在莱茵衣藻中分离并鉴定出了除HydA1外的另一种氢化酶 HydA2 的表达［25］。此外，研究证实，添加光合抑制剂能够显著抑制栅藻和胞藻的氢化酶活性，减少氢气的产生［26-27］。低等动物中也有相关报道，例如，Nývltová等［28］在原生动物的胞浆和线粒体中均发现具有固氮作用的氢化酶样蛋白的存在。

2.3 高等植物的氢化酶活性

本小节主要从高等植物的氢代谢现象和氢干预对高等植物生长的影响两方面介绍高等植物氢化酶活性的相关研究进展。

2.3.1 高等植物的氢代谢现象 由于藻类产生的氢气可以作为生物能源，这在新能源领域有重要价值，因此目前植物中的氢气代谢研究主要集中于藻类等低等植物。高等植物的氢气代谢研究相对进展缓慢。1946年，Boichenko等［29］发现体外分离的藻类叶绿体可以产生氢气，由此推测在某些高等植物体内可能也存在氢化酶。1964年，Renwick等［30］研究证实冬黑麦、萝卜、豌豆、西红柿这几种植物的种子在萌发过程中具有产氢能力。1982年，Mal'tsev等［31］发现离体豌豆叶绿体能够产生和消耗氢气，但并无后续研究，此前有关高等植物吸氢酶活性只有这一篇报道。之后，有研究进一步揭示了豌豆叶绿体中的产氢位点位于光系统Ⅱ［4］。近年来，研究陆续发现水稻、苜蓿和拟南芥等高等植物均可产生内源性氢气［5-6，32］。另外，本团队的最新研究表明，从绿豆芽下胚轴与辣椒幼苗茎段纯化出的质膜中存在同时具有产氢和吸氢活性的氢化酶样蛋白［33］。不同种高等植物中的氢代谢现象汇总见表1。

表1 不同高等植物中的氢代谢现象Table 1 Hydrogen metabolism in different higher plants

2.3.2 氢干预对高等植物生长的影响 与氢气的医学效应相比，氢气的植物学效应（氢农业相关）研究相对滞后。目前已有研究证据表明，氢气对植物的生长发育和抗逆性有积极影响［34］。这主要体现在：一方面氢气可提高植物对生物和非生物胁迫的抗/耐性，如增强耐旱性和耐盐性、抵御重金属离子胁迫、缓解冷胁迫和热胁迫、减轻紫外线或高光伤害、提高抗病性等；另一方面氢气还参与调控植物生长发育和改善营养品质，如促进种子萌发、参与调控植物不定根和侧根的发育、提高蔬菜营养品质、参与水果和花卉保鲜等。氢分子对高等植物的一些生理过程调控汇总详见表2。虽然已经发现了氢气的多种植物学效应，但是这些植物学效应的分子机理目前尚未明确。初步研究表明，氢气植物学效应的分子机制可能涉及miRNA、基因与蛋白表达、激素水平和蛋白翻译后修饰的调控、还原Fe3+、调节酶活性等［34-35］。

表2 氢分子对高等植物生理过程的调控Table 2 Regulation of some physiological processes in higher plants by hydrogen molecules

3 高等植物线粒体具有氢化酶活性的猜想与依据

3.1 高等植物氢化酶研究现状与猜想

尽管高等植物产氢现象已有报道，但是目前对催化产氢的关键酶蛋白还了解较少。根据与绿藻、细菌中的［Fe-Fe］氢化酶序列同源性，人们已经在拟南芥、苜蓿和水稻中发现了一些［Fe-Fe］氢化酶样蛋白。拟南芥中的［Fe-Fe］氢化酶样蛋白被称为核构架相关蛋白-1（nuclear architecture-related protein 1，NAR-1），该蛋白定位在细胞浆中，参与FeS蛋白的组装过程，与对非生物胁迫的响应有关［41］。在苜蓿中，［Fe-Fe］氢化酶样蛋白称为GOLLUM，定位于核质区域，该蛋白在植物适应环境中氧分压的改变时发挥重要作用，同时在植物生长发育和细胞周期进程中也是必需的［42］。然而在这些研究中并没有检测［Fe-Fe］氢化酶样蛋白是否能产氢。在另一项研究中虽然检测到水稻幼苗的产氢特性，同时通过蛋白同源性分析预测了水稻中的氢化酶基因（OsHydA1、OsFhdB和OsHypB），并发现当水稻幼苗的根在受到盐胁迫时这些基因的表达水平显著升高，同时检测到幼苗产氢量也明显升高［32］，但是该研究没有对氢化酶蛋白做进一步鉴定，同时也没有明确幼苗产氢是否由氢化酶催化。

一些研究发现真核细胞线粒体中可能有氢化酶存在，如2013年Nývltová等［28］在原生动物的胞浆和线粒体中均发现有氢化酶样蛋白的存在，但目前在高等植物线粒体中还没有关于氢化酶活性的报道。综合目前的研究来看，高等植物的氢代谢以及氢化酶研究还处于初步阶段。但是结合已有的高等植物的产氢现象和氢干预对植物的明显影响，植物无叶绿体部分也具有产氢能力的现象以及上述高等植物中发现的氢化酶同源基因与氢化酶样蛋白的存在，可以初步提出高等植物线粒体具有氢化酶活性的猜想。除了上述猜想依据外，下文将从线粒体与氢化酶体在进化上的同源性以及线粒体复合物Ⅰ与氢化酶的关系进行分析，进一步为该猜想提供更多依据。

3.2 高等植物线粒体具有氢化酶活性的依据

3.2.1 线粒体与氢化酶体在进化上的同源性 线粒体作为真核细胞的最原始特征之一，于不同种真核生物的独立进化过程中，在形式和功能上逐渐出现多样化，由此产生了一系列具有不同蛋白质组和表型的同源细胞器。氢化酶体便是在厌氧型原生动物和厌氧型真菌中发现的一种线粒体同源细胞器［43］，它是一种由膜包裹的球状细胞器，内含氢化酶和氧化还原酶类，可利用［Fe-Fe］氢化酶产生 H2［44］。

关于氢化酶体的起源，目前有两种假说。第一种假说认为，原始的线粒体内共生体产生了需氧代谢型的线粒体，线粒体随后通过获得编码无氧代谢所必需酶的基因进化为氢化酶体，即氢化酶体是线粒体的进化产物。第二种假说认为，氢化酶体和线粒体起源于同一个兼性厌氧内共生体的祖先，然后在真核生物进化过程中逐渐分化为需氧型和厌氧型。Boxma等［45］的研究表明，在纤毛虫（Nyctotherus ovalis）中存在一种氢化酶体，其保留了编码线粒体电子传递链成分的原始基因组。另外，他们也证实了该氢化酶体对线粒体复合物Ⅰ的抑制剂敏感，并且具有厌氧线粒体的典型生化特性——产生琥珀酸作为一个主要的代谢终产物［46］，这些研究结果为氢化酶体起源于一种厌氧线粒体的观点提供了新的支持。综上，线粒体和氢化酶体这种具有氢代谢能力的细胞器的密切关系提示氢气的作用目标可能在线粒体内。

3.2.2 线粒体复合物Ⅰ与氢化酶的关系 1990年，Böhm等［47］发现线粒体复合物Ⅰ和［Ni-Fe］氢化酶存在同源关系，［Ni-Fe］氢化酶能把氢气氧化和质子跨膜转运偶联起来，这就类似线粒体复合物的功能。2011年，Moparthi等［48］研究发现，复合物Ⅰ的NADH脱氢酶模块中的G亚基与［Fe］氢化酶类似，而醌模块中的B和D亚基分别与可溶性［Ni-Fe］氢化酶的小亚基和大亚基相似。同时，在超高温古生菌强烈炽热球菌中发现了一种包含14个亚基的膜结合氢化酶，该氢化酶中的膜锚定模块在结构上与复合物Ⅰ的醌结合Q模块高度相似［49］。这些证据表明，线粒体和氢化酶存在同源关系，线粒体复合物Ⅰ很可能是从细菌的氢化酶进化而来的。

虽然线粒体与氢化酶的同源关系研究已有很多，但是关于高等植物线粒体是否存在氢化酶活性目前还了解较少。本团队前期研究［50］发现，在拟南芥、绿豆以及大豆种子萌发过程中均有氢气产生，并证实这种内源性氢气的产生与微生物污染无关，这提示氢化酶可能在高等植物中广泛存在。在对绿豆下胚轴进行细胞组分分离后发现，线粒体组分具有较强的产氢活性。进一步研究发现，纯化后的线粒体可以产氢，同时发现在拟南芥和大豆线粒体中也有产氢活性，提示高等植物线粒体可能普遍存在氢化酶活性。为了进一步确定线粒体产氢的具体部位，实验中加入了不同的线粒体抑制剂来观察对产氢的影响，结果发现加入鱼藤酮（复合物Ⅰ的抑制剂）后产氢量显著下降，提示线粒体复合物Ⅰ可能存在氢化酶活性。同时研究还发现缺氧可显著促进线粒体产氢，采用代谢组学方法监测线粒体TCA循环关键代谢产物水平变化发现，TCA代谢物水平的变化与线粒体产氢密切相关，其中缺氧时琥珀酸水平在产氢高峰前后相差近百倍，常氧和缺氧状态下的电子传递链分别如图1（A、B）所示。

据此我们提出了高等植物线粒体的产氢机理假说，如图1所示，将线粒体产氢分为了三个阶段。①在常氧状态下或在缺氧的早期阶段（Ⅰ期）：TCA循环正常运行，α-酮戊二酸被氧化为琥珀酸，来自NADH的电子沿复合物Ⅰ的FeS簇转移到N2位点，再继续传递给Q1st（产生UQ·-的第一个UQ结合位点）和Q2nd（产生UQH2的第二个UQ结合位点）形成UQH2，此时不产生氢气（泛醌能够以3种不同的氧化还原状态存在，即氧化型（UQ）、半还原型［（UQ·-）和还原型（UQH2）］；②在缺氧状态下（Ⅱ期）：电子通过复合物Ⅲ和复合物Ⅳ传递给氧气的通路被抑制，导致复合物Ⅰ和复合物Ⅱ催化的电子传递至复合物Ⅲ的常规通路受到抑制，因此电子在复合物Ⅰ和复合物Ⅱ之间开启了内循环模式。复合物Ⅰ的电子通过泛醌直接传递给复合物Ⅱ，复合物Ⅱ接受电子后催化从延胡索酸到琥珀酸的逆反应并将电子储存在琥珀酸中。在此阶段末期，累积的琥珀酸压力增大，复合物Ⅱ的催化反应受到反馈抑制，还原型泛醌（UQH2）的电子传递被抑制程度增加，导致氧化型泛醌（UQ）缺乏，复合物Ⅰ传递到N2位点的电子无法继续传递。进而，复合物Ⅰ→UQ→复合物Ⅱ的通路被抑制，电子在复合物Ⅰ的N2位点附近累积，因此在复合物Ⅰ的N2附近有电子也有质子，并且缺乏与质子竞争接受电子的UQ，于是电子与质子结合开始生成氢气；③在长期缺氧情况下（Ⅲ期）产生大量氢气：随着琥珀酸的积累和UQ的缺乏，电子经复合物Ⅰ→UQ→复合物Ⅱ传递给琥珀酸的通路也被抑制，TCA逆行受阻，此时复合物Ⅱ催化的琥珀酸和延胡索酸的双向反应均被抑制，从α-酮戊二酸到琥珀酸的正常TCA循环又占主导地位，琥珀酸水平进一步增加，从而产生大量氢气。虽然以上实验证据已经初步证实高等植物线粒体存在氢化酶活性，但还有许多未解之谜，例如，线粒体氢化酶蛋白的鉴定、产氢的质子来源、线粒体产氢的生理意义等。相信随着研究的进一步深入，人们对氢气的作用机理以及线粒体功能会有全新的认识。

图1 线粒体产氢机制示意图[50]Fig.1 The schematic diagram of H2evolution mechanism in mitochondria[50]

根据以上内容，高等植物细胞内的多个潜在氢化酶活性位点已被揭示，包括线粒体复合物Ⅰ、叶绿体光系统Ⅱ、分别定位于胞浆和核质的氢化酶样蛋白NAR-1和GOLLUM，以及在质膜上发现的氢化酶样蛋白，各位点在细胞中的定位与具体的氢代谢情况详见图2。

图2 高等植物潜在氢化酶的亚细胞定位及其催化活性Fig.2 The subcellular localization and catalytic activity of the potential hydrogenase in higher pants

4 展望

高等植物的氢代谢现象以及氢干预对植物生理过程具有明显影响，植物无叶绿体部分也具有产氢能力，研究发现高等植物中也存在氢化酶同源基因与氢化酶样蛋白，氢化酶体与线粒体在进化等方面关系密切，线粒体复合物Ⅰ与氢化酶具有同源性，以上证据不仅表明了高等植物具有氢化酶活性，并且提示这种活性与植物线粒体尤其是线粒体中电子传递链的复合物Ⅰ密切相关。然而，目前关于高等植物的氢代谢以及氢化酶研究还处于初步阶段，若想要完全证实高等植物线粒体具有氢化酶活性并进一步确定该氢化酶的定位与特性，仍需要后续相关实验进行验证。

若高等植物线粒体具有氢化酶活性的假说最终被证实，将有助于我们理解真核生物的进化过程，同时也会使我们对真核生物线粒体的功能有全新的认识。此外，从整个氢气生物学的层面来看，虽然目前已经发现了氢气的多种生物学效应，但是关于氢分子的作用机理研究尚不成熟，目前已经提出的选择性抗氧化假说、生物酶假说与信号分子假说均存在一定的片面性或相关研究不充分的情况［51］，并不能很好地解释氢气的广泛生物学效应，这在很大程度上制约了氢气生物学的发展。高等植物线粒体具有氢化酶活性的假说将氢气代谢与能量及细胞代谢紧密的联系起来，试图从源头上找到氢气发挥生物学效应的底层机制，有望彻底揭开氢分子的作用机理。