压力旋流喷染技术在血涂片染色中的研究与应用

王国伟 李旺鑫 梅 茜∗ 董文飞

1(中国科学技术大学生物医学工程学院(苏州)生命科学与医学部，合肥 230026)

2(中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，江苏 苏州 215163)

3(济南国科医工科技发展有限公司，济南 250101)

引言

血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学分析的金标准，在临床检验中占有重要地位，其制片质量也会影响病理诊断结果[1-3]。 然而长期以来，临床上小批量的血涂片染色通常是由检验医师人工滴加染液进行染色[4]，这种染色方法，不仅染液消耗量大，还会由于染液的混合不均匀导致染色深浅不一、染料沉积，最终制作的血涂片难以实现标准化。 目前大型医院使用的血液分析流水线包含自动化染色模块，采用竖直式的染色盒和浸染的方式对血涂片进行染色，染液消耗量较大，因为只有染色盒顶部一处开口，染色液的灌入和吸出、以及空气干燥都只能从染色盒顶部开口处往下进行，而且仪器结构复杂，价格昂贵，维护成本高，不适用于小批量的血涂片染色场景。 因此，改进血涂片的染色方式，提高小批量血涂片染色的效率与质量，具有重要的研究意义。

喷染是一种借助雾化喷头将染液喷在物体表面的染色方式，具有染色均匀，染色效率高等优点[5]。 雾化喷头作为喷染系统的关键元件之一，种类繁多，用途广泛[6-9]，而压力旋流雾化喷头凭借其结构简单，维护方便，工作压力较低[10]等优点，被应用于各种工业场景。 国内外研究者针对压力旋流雾化喷头开展了一系列的理论分析及实验研究。潘华辰等[11]通过数值模拟和实验相结合的方法分析了切向槽位置和倾斜角对雾化效果的影响规律；刘赵淼等[12]开发一种内部尺寸参数较小的压力旋流雾化喷头，分析在不同注压下的锥形液膜流动、破碎及雾化特性，并总结旋流槽数目对液膜流速、喷雾锥角、雾滴粒径及均匀度等参数的影响；Sun等[13]对一种直叶片压力旋流雾化喷头进行内部流场数值模拟和外部雾滴速度场测试，获得喷头外流场速度分布随入口压力的变化规律；Amini[14]通过理论计算和实验验证喷头几何形状和进口流动条件对喷头性能的影响；Bang 等[15]建立了不同几何形状的收敛喷嘴内旋流式厚膜流动的理论模型，分析喷头结构的变化对雾化参数的影响；王健等[16]和程卫民等[17]分析了压力雾化喷头在采矿降尘领域中的应用；刘绍彦等[18]对影响压力旋流雾化喷头喷雾冷却的因素进行了研究。 目前大多数研究主要针对压力旋流雾化喷头的结构变化对外部流场参数的影响分析以及其在工业领域中的应用，但还缺少针对血涂片喷染的喷头设计及应用开发。

本研究针对喷染血涂片的实际需求，改进并制备一种具有4 个切向注入口的小型低压旋流雾化喷头，并开展了模拟仿真和系列实验验证。 首先通过建模仿真分析喷头内部的染液流动特性，然后构建喷头外部雾化场测试系统探索适宜的喷染参数，最终开展血涂片的喷染实验应用，为高效率、高质量血涂片染色提供了一种新思路。

1 方法

1.1 喷头的基本结构

由于每张血涂片所需染液较少，且需要染液均匀覆盖，本研究选用了一种具有4 个切向注入口的小型压力旋流雾化喷头，并对喷头的内部尺寸进行了优化，如图1 所示，主要由喷头芯和喷头帽两部分组成，染液入口直径为3 mm，每个旋流入口截面为0.5 mm×0.3 mm 的矩形，并且与旋流室相切连接，旋流室上部直径为2 mm，喷头出口直径为0.4 mm。喷头入口压力范围为0～0.3 MPa，使用聚丙烯材料注塑加工而成。 其工作机制是染液在压力的作用下由喷头入口进入喷头空腔，然后经4 个切向注入口进入旋流室内并形成旋流，在离心力作用下沿锥形旋流室内壁做高速旋转运动，由于旋流室采用倒锥形结构，当染液流动到旋流室末端时将获得较大的轴向速度和径向速度，因此染液在喷头出口处会以锥形液膜的形式喷出。 高速液膜再与空气相对剧烈运动，撕裂破碎成细小的雾滴[19-20]。 喷头的核心结构是旋流切向注入口和锥形旋流室，如图1(c)所示，染液朝着箭头所指方向流动，4 个染液注入口末端分别与旋流室相切，其直接影响染液喷出时的雾化状态。

图1 压力旋流喷头结构。 (a)喷头模型；(b)喷头实物图；(c)旋流室结构和染液流动方向示意Fig.1 Structure diagram of pressure swirl nozzle.(a) Nozzle model； (b) Nozzle picture； (c) The photograph of swirling chamber and the schematic diagram of the staining solution flow direction

1.2 喷头内部结构的仿真分析

喷头内部的染液流动状态对喷头出口的雾化场及雾化特征参数具有重要影响。 然而喷头结构紧密，内部尺寸参数较小，染液在喷头内部的流动状态不易观察，通常使用仿真分析的方法研究喷头内部的流动特性。 由于切向注入口和旋流室是喷头的核心结构，直接影响染液喷出时的雾化状态，本研究将主要对喷头的旋流切向注入口和旋流室进行流体仿真。

染液在旋流室内的流动状态为湍流流动，且为不可压缩流体。 在忽略重力、热量交换等因素影响后其基本控制方程主要包括连续性方程、动量方程。

连续性方程为

动量方程为

式中，ρ为流体等效密度，u为场速度矢量，P为作用在流体微元上的压力，F为作用在流体微元上的体积力，μ为流体等效动力粘度[21]。

采用ANSYS Workbench 软件对喷头结构内部流道建立流体力学模型进行仿真。 首先将模型导入ANSYS 的前处理软件Meshing 中进行网格划分和边界条件界定，然后选用FLUENT 软件进行双精度模拟分析，其中湍流模型选用带旋流修正的Realizablek-ε 模型[22-23]，流道内瑞氏－姬姆萨染液的物理参数按照表1 进行初始设置，入口边界为4个旋流切向注入口，设置为压力，喷头出口边界条件设置为一个标准大气压。 喷头固体壁面设定为无滑移绝热壁面，近壁区采用标准壁面函数法处理。 求解器中压力与速度的耦合采用SIMPLEC 算法进行求解。

表1 仿真材料参数Tab.1 Material parameters defined for simulation

1.3 喷头外部雾化场实验

1.3.1 构建雾化场测试系统

针对染液从喷头出口喷出后的雾化特性，图2所示为用于确定喷染雾化参数的喷头外部雾化场测试系统示意。 系统主要由染液输出装置、粒径分析装置及雾化角拍摄装置等三部分组成。 染液瓶中的瑞氏－姬姆萨染液通过3 mm 内径软管流经过滤器、微型隔膜泵(DL200EEDC，武汉优利可科技公司，中国)、稳压阀、压力表(YN60BF，上海笠聚)，最后经雾化喷头喷出。 此微型隔膜泵结构紧凑、脉冲较小、功耗低且有自吸功能，可以满足实验需求。压力表测量染液注入喷头时的压力，压力表量程在0～0.4 MPa。

图2 雾化实验系统示意Fig.2 Schematic illustration of experimental platform for performance measurement of atomization

首先使用坐标控制器调节坐标架进而改变喷头的高度，然后利用喷雾激光粒度仪测量雾化区域不同位置的雾滴粒径。 本实验系统使用的是成都精新的JL－3000A 型喷雾激光粒度仪，其工作原理基于全量程米氏散射理论[24]。 650 nm 发射波长激光经过雾化区域时，不同直径的雾滴散射光的强度不同，接收端经过数据处理与分析反推会得到不同直径的雾滴的分布参数，由激光粒度仪将雾滴分布信息传输给计算机专用软件，得到直观的雾滴分布数据。 同时，此粒度仪有128 级多元探测器，粒径分档多，级差小，散射信号检测精细且具有较高的分辨率，测量范围在0.1～3 000 μm。 在暗室通过相机结合LED 光源对雾化区域进行拍摄，可采集喷头外部雾化场的雾化角图像。

1.3.2 测量染液喷出雾化角

雾化角与雾化场的空间区域以及雾滴的分布直接相关，染液从喷头出口喷出后扩散成近似锥形的雾化形态，通过测量雾化场两条外边缘切线的夹角，可以测得雾化角θ，如图3 所示，已知雾化角θ，血涂片需要染色的喷射宽度范围L＝55 mm，则利用式(3)确定喷染过程中需要完全覆盖血涂片待染色区域时，血涂片与喷头的最小距离参数h。

图3 染液覆盖区域示意Fig.3 Schematic diagram of the stain-covered area

为分析喷头入口压力变化对雾化角的影响，确定不同喷头入口压力下的最小距离参数h，在暗室里将光源布置在离心喷嘴正下方，通过相机拍摄喷头喷出的雾化角图像。 根据喷头入口压力范围选取实验压力分别为0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa，采集相应的雾化角图像，并测量对应雾化角，为减少测量误差，准确评估雾化角大小，每个实验压力下分别拍摄5 张图像进行测量，并取平均值。

1.3.3 测量染液喷出粒径参数

喷头雾化区域的雾滴通过液膜撕裂破碎而成，虽然雾滴颗粒的形状不尽相同，但可以通过雾滴粒径大小及分布情况分析雾化过程及雾滴分布规律。常用的方法是假设雾滴形状都近似为球形，使用统计学方法定义平均雾滴粒径，通过平均粒径来描述喷雾的雾滴粒径特性。 目前常用的评估参数是雾滴体积中径和粒度分布跨度S。 雾滴体积中径用Dv50表示直径小于Dv50的雾滴占全部雾滴体积的50%，以表征该区域内雾滴的直径大小。 在相同染液体积下，Dv50数值越小，说明雾滴的数目越多，雾化质量也更高。 同理Dv90和Dv10分别表示该粒径及以下的雾滴体积占测试区域内雾滴体积的90%和10%。 粒度分布跨度的计算如下:

以上数值均通过激光粒度仪检测输出，然后再进行计算得出粒度分布跨度值，其可以直观反应出雾滴的均匀性，值越小，其均匀性越好，雾化效果越好。

通过测量不同喷头入口压力下距离喷头不同位置的Dv50，分析雾化空间区域内液膜破碎过程及雾滴的变化规律，寻找稳定状态下的喷染界面。 根据现有的血涂片的制作方式，前期工作表明铺展在载玻片上的细胞主要分为头端，体端，尾端等3 个区域，而位于血涂片中间位置的体端和尾端交界区域，其细胞铺展均匀，单个分散不重叠，后续显微镜检查也主要选取此位置进行细胞观察与分析[25]。并且喷头中轴线正对体端和尾端交界区域，该区域的细胞染色质量好坏直接影响后续的显微镜检查，所以重点分析喷头中轴线附近区域的粒径参数。如图4 所示，选取喷头正下方10 ～50 mm 的雾化区域，沿轴向每5 mm 取一个测试点，每个测试点的外部入口压力分别选取0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa，测得雾滴的粒径分布参数。

图4 测试区域示意Fig.4 Schematic diagram of the test area

1.3.4 测量不同喷头入口压力下的喷头流量

血涂片在染色过程中，需要将瑞氏－姬姆萨染液与缓冲液按一定比例混合，因此需要控制染液的用量。 通过使用流量计，测量喷头入口压力从0 增至0.25 MPa 时，喷头的流量变化。

1.3.5 血涂片喷染实验验证

为了验证该小型压力旋流雾化喷头在血涂片染色中的应用效果，选用细胞图像背景的灰度值进行分析。 灰度是指黑白图像中的颜色深浅，范围一般为0～255，白色为255，黑色为0，因此灰度值越大，其背景颜色越浅。 同时选用图像背景颜色的灰度跨度值进行染色均匀性的分析，灰度跨度值等于区域内最大灰度值与最小灰度值的差值与平均灰度值的比值，因此灰度跨度值越小，其染色越均匀。分别对血涂片进行瑞氏－姬姆萨喷染和传统人工滴液染色，其中喷染的过程是将血涂片放置于喷头正下方35 mm，喷头入口压力为0.20 MPa。 首先喷出瑞氏－姬姆萨染液约0.5 mL 于血涂片上，静置染色1 min，然后用另一个喷头喷出磷酸缓冲液1 mL 于血涂片上，待缓冲液和染液充分混合后静置3 min，最后用去离子水进行充分冲洗，待干燥后置于显微镜下对血涂片上的细胞分布图像进行采集与分析。在相同显微镜条件下，喷染和滴染后的血涂片细胞图像各采集10 张，通过ImageJ 软件分别测量了人工滴染与喷染后的细胞图像背景灰度参数，并对喷染后的细胞图像平均灰度值、灰度跨度值和滴染后的平均灰度值、灰度跨度值分别进行双侧t检验，P<0.05 为有显著性差异。

2 结果

2.1 喷头内部流场的仿真结果

喷头核心结构的物理模型生成如图5(a)所示的非结构化四面体网格。 当切向注入口压力为0.15 MPa，染液开始进入旋流室直到从出口喷出的填充过程模拟结果如图5(b)和(c)所示。 图5(b)为染液在旋流室内的压力变化过程，由于染液在旋流室内有较高的切向速度，高速旋转的染液使得压力沿着半径方向由壁面向中心处递减，因此会在旋流室中心轴线形成空心负压区，负压区的形成会吸引空气进入旋流室形成气核，气核会挤压出口处的染液，使其形成高速液膜从出口喷出。 染液在压力的作用下由4 个切向注入口同时进入旋流室，其速度随时间的变化如图5(c)所示，在旋流室内，由于越靠近旋流室中心，染液旋流强度越大，切向速度也就越大，因此中心区域的旋流速度比边界部分的速度更大。 流体同时具有切向速度和轴向速度，因此染液沿着旋流室内壁旋转的同时朝着出口方向流动，在2.5 ms 内就可以实现从喷头出口高速喷出。

图5 喷头内部流场仿真结果。 (a)内部流道的仿真模型；(b)旋流生成过程中的压力变化；(c)旋流生成过程中的速度变化；(d)不同注入压力下喷头出口速度矢量图Fig.5 The simulation results of flow field in the nozzle.(a) Simulation model of the internal flow channel；(b) Pressure changes with the swirling formation；(c) Changing of velocity during the swirling formation；(d) Vector diagram of nozzle outlet velocity at different injection pressures

切向注入口压力的变化直接影响染液喷出的速度，在喷头压力范围内当入口压力分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 MPa 时，其出口速度矢量图变化如图5(d)所示。 喷头出口的速度随着注入压力的增大而逐渐增大，这是因为压力的增大导致喷头内染液的旋流强度增加，最终转化为染液喷出时的动能。

2.2 染液喷出雾化角

不同喷头入口压力下的雾化图像及雾化场外边缘切线如图6 所示，通过ImageJ 软件进行了角度测量。 当喷头入口压力从0.1 MPa 逐渐增大到0.24 MPa 时，喷头的喷雾角从56.72°增大到了77.17°。 当喷头入口压力达到0.20 MPa 后，雾化角最终稳定于76°～78°之间。 喷头的雾化角的变化规律及对应的距离参数h变化由表2 所示。 结合对喷头内部流场的模拟分析可知染液在喷头内部的旋流强度会随着喷头入口压力的增大而增大，并且由于喷头出口处的轴向速度增大速率小于切向速度的增大速率，使得喷出染液的液膜拉伸范围变大，所以雾化角也随之增大。 但随着压力的增大到0.20 MPa 后，由于喷头内部摩擦损失增大，使得切向速度的增大速率变缓，因此随着压力的增大雾化角不再产生较大变化，并且趋于稳定，通过以上数据可知在选择的压力范围内血涂片与喷头的最小距离参数在34～51 mm 之间。

图6 不同喷头入口压力下的雾化角Fig.6 Images of spray angle at different nozzle inlet pressures

表2 不同喷头入口压力下所需要的最小距离Tab.2 Minimum distance at different nozzle inlet pressures

2.3 染液喷出粒径参数

在不同的喷头入口压力下，距离喷头不同位置的雾滴体积中径Dv50的变化如图7 所示，当压力一定时，测试区域内雾滴粒径随着与喷头的距离增大而呈减小趋势，并且最终趋于稳定，这是因为刚开始液膜从喷头出口喷出时首先要经历破碎阶段，此时测得的雾滴粒径较大，但随着液膜受到表面张力和离心力的不断作用，其逐渐破碎成更小的雾滴，最终达到稳定的状态。 随着压力的增大，液膜受到的作用力也会随之增大，因此液膜破碎达到稳定状态所需要的距离也在不断减小。 当喷头入口压力为0.10 和0.12 MPa 时，注入压力较小，使液膜破碎的作用力也较小，导致在选取的范围内锥形液膜不能有效破裂，所以雾滴粒径还在上下波动，未达到稳定的状态。 当喷头入口压力为0.14 和0.16 MPa时，雾滴粒径在距离喷头40 mm 处开始趋于稳定，Dv50分别稳定在98～100 μm，78～80 μm 之间。 当喷头入口压力为0.18 和0.20 MPa 时，雾滴粒径在距离喷头35 mm 处开始趋于稳定，Dv50稳定在74～77 μm 之间。 当喷头入口压力为0.22 和0.24 MPa时，在距离喷头30 mm 处，雾滴粒径已开始趋于稳定。 当喷头入口压力为0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa 时，稳定状态下的Dv50明显比喷头入口压力为0.14 MPa 时的Dv50小，染液的雾化质量也更高。

图7 不同喷头入口压力下测试点的Dv 50Fig.7 Droplet volume median diameter at different nozzle inlet pressures

如表3 所示，结合2.2 节对不同喷头入口压力下所需最小距离参数h的分析，分别测量了压力为0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa 时稳定界面的粒径参数，且计算了粒度分布跨度S。 对比分析5 种情况下的粒度分布跨度，当喷头入口压力为0.2 MPa，与喷头的距离h为35 mm 处的喷染界面测得的粒度分布跨度最小，雾滴分布最均匀，雾化效果较好。 因此选取此参数条件对血涂片进行染色。

表3 5 个稳定界面的粒径参数Tab.3 Particle size parameters of five stable interfaces

2.4 注入压力对喷头流量的影响结果

如图8 所示，当喷头的入口压力从0 增加到0.25 MPa时，由于压力的增大导致染液的旋流强度和速度也都随之增大，使得喷头的流量逐渐增至103 mL/min，当压力逐渐升高到一定值时，染液在喷头内部的损失变大使得出口速度增大速率下降，并且由于喷头的出口孔径固定不变，喷头流量随压力增大而增大的趋势放缓。 根据喷头流量随喷头入口压力的变化情况，可以控制每张血涂片的染液使用及混合情况，从而提高血涂片的染色质量。

图8 不同喷头入口压力下的染液流量Fig.8 Flow rate of staining solution at the various nozzle inlet pressures

2.5 血涂片喷染实验结果

经过喷染、冲洗、干燥等操作后的血细胞在显微镜下观察和采集图像(见图9)，染色后有核细胞为白细胞，细胞核呈紫红色，无核细胞为红细胞，呈粉色。 如表4 所示，分别随机选取10 张人工滴染和喷染后的细胞图像，人工滴染后的细胞图像的平均灰度值为237.70±2.74，而喷染后的平均灰度值为245.02±3.75，喷染和滴染后的细胞图像平均灰度值存在显著性差异(P<0.01)，喷染后的细胞图像背景更趋向于白色。 此外，人工滴染后的血涂片细胞图像的灰度跨度的均值为0.172±0.062，而喷头喷染后的灰度跨度为0.035±0.010，喷染和滴染后的细胞图像灰度跨度值存在显著性差异(P<0.01)，喷染后的细胞图像背景灰度显著降低。 综上分析，喷染后的血涂片背景色更浅、染色更均匀，有利于后续的鉴别、分类、计数等操作。

图9 染色后的血细胞图像。 (a)喷染后的血细胞；(b)滴染后的血细胞Fig.9 Image of stained blood cells.(a) Blood cells after spray staining； ( b ) Blood cells after drip staining

表4 细胞背景图像灰度参数Tab.4 Background gray parameters of cell image

3 讨论

血涂片染色作为血涂片制作过程中重要的一个环节，目前主要通过自动化设备浸染和人工滴染两种方式进行。 市场上现有的自动化设备主要是通过染色架使血涂片依次通过不同的试剂槽，实现对载玻片的染色，比如德国徕卡公司研制的HistoCore SPECTRA ST 染色机，能够同时对上百张载玻片进行染色，工作效率高。 但是试剂长时间暴露在空气中会出现染液变性，随着染色批次的增加，染色质量会下降等问题[26]；并且浸染设备结构复杂，体积庞大、价格昂贵、维护成本高[4]，所以主要应用于大型三甲医院，并不适用于小型社区医院和科研机构等场所。 目前小批量的血涂片染色仍以人工操作为主，缺乏合适的自动化染色方案。 本研究提出了基于雾化喷头的血涂片喷染方法用于血涂片小批量染色。

本研究首先改进并制备了一种针对血涂片染色的小型压力旋流雾化喷头，并对喷头的旋流室、切向注入口等核心部件进行仿真模拟，通过改变染液的速度和压力分析了染液在喷头内的流动状态，染液在喷头内获得切向速度和轴向速度，然后在出口处形成高速液膜，为雾化场的形成奠定基础[27]。接着本研究构建了一套喷头外部雾化场测试系统探索喷头外部雾化场的最佳性能参数，通过相机拍摄不同喷头入口压力下的雾化图像，并测量其雾化角，分析了不同喷头入口压力下的喷头雾化角及覆盖整个血涂片所需要的最小距离。 使用激光粒度仪分析了不同压力下，距离喷头出口不同高度的雾滴体积中径Dv50和粒度分布跨度S，发现压力越小，染液从出口喷出到稳定状态所需要的距离越远，并且压力过小会导致染液不能有效破碎且达不到稳定的状态[12]。 对不同注入压力下所需最小距离参数的计算，对比了五个稳定界面的粒度分布跨度确定了最佳的喷染参数。 最后通过对比表明喷染和滴染后的细胞图像背景灰度参数存在显著性差异(P<0.01)，喷染后的细胞图像背景灰度显著降低。证明了压力旋流雾化喷头可以应用于血涂片染色，并且具备较好的染色效果。

血涂片染色所使用的瑞氏－姬姆萨染液主要是由瑞氏色素和姬姆萨色素充分溶解在甲醇中配制而成，经检测该溶液是一种低粘度的溶液。 同样用于血涂片染色的瑞氏染液和姬姆萨染液也是由甲醇分别溶解色素配置而成，经过实验，该喷头可以满足以甲醇为主要溶剂的血涂片染液的雾化需求，并且制备喷头所使用的聚丙烯材料对甲醇具有很好的耐腐蚀性。 同时生物医学检验领域中常用的苏木素伊红染色，革兰氏染色[28]使用的试剂也是一些低粘度的溶液，在后续的研究中可以扩展该雾化喷头的应用范围与使用场景。

由于染液在雾化后会产生一些悬浮在空中的细小雾滴，并且在喷染时会产生废液，在接下来搭建自动化喷染仪器时要特别注意染色空间的密封性，并且增加活性炭等吸附装置。 在后续研究中将进一步优化喷头的流量，降低染液的消耗。

4 结论

本研究提出了一种基于压力旋流式雾化喷头的血涂片染色方法，通过对喷头内部结构的流体仿真以及对喷头外部雾化场的实验分析，确定了当喷头的外部入口压力为0.20 MPa，喷染界面位于喷头正下方35 mm 时，具备最优的雾化质量。 并且与人工滴染后的细胞图像对比发现，喷染和滴染后的细胞图像背景灰度参数存在显著性差异(P<0.01)，喷染后的细胞图像背景灰度显著降低，染色更均匀，表明该喷头喷染血涂片取得了较好的染色效果，为血涂片染色提供了新的方案。 后续将围绕该压力旋流雾化喷头搭建封闭式喷染仪器，实现对血涂片的全自动批量喷染，提高血涂片的染色效率和染色质量。