中亚苦蒿醇提物诱导人食管癌细胞凋亡及其作用机制的研究∗

夏丽洁，迪丽尼格尔·孜亚依丁，魏仙仙，蒋静雯，李金耀

(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830017)

0 引言

食管癌是常见的消化道肿瘤之一，是由食管鳞状上皮或腺上皮的异常增生所形成的恶性病变，患者的5年生存率仅为10%[1].目前，食管癌常用的治疗手段是手术、放疗、化疗和免疫治疗等.这些治疗手段在提高治疗效果、延长生存期及提高生活质量方面起到了一定的作用，但大部分的食管癌患者在诊断时已处于中晚期，手术后复发率和转移率较高，而且放疗和化疗副作用大[2].因此，迫切需要开发新型食管癌治疗药物，以提高治疗效果及患者生存质量.

寻找天然抗癌活性成分是抗癌药物研究的一个重要途径，源自天然中草药提取物具有多靶点、多效应的特点，不易产生耐药性，在肿瘤的预防和治疗方面具有其独特优势.中亚苦蒿（Artemisia absinthiumL.）为菊科蒿属植物，含有挥发油类、萜类、黄酮类、木脂素类、生物碱类等多种活性成分[3].药用历史悠久，其叶和花枝具有清热解毒、消炎镇痛、活血消肿等功效[4].中亚苦蒿药理作用研究表明其乙醇提取物具有较好的抗菌和抗寄生虫活性[5−6]，同时具有抗氧化、清除自由基等功能[7].Shafi等[8]研究发现，中亚苦蒿甲醇提取物可通过激活caspase-7、调节Bcl-2家族蛋白与MEK/ERK通路，诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡.中亚苦蒿的化学成分复杂，其主要活性成分的药理作用和抗肿瘤分子机理还有待进一步研究.

本课题组前期研究发现中亚苦蒿醇提物（A.absinthiumethanol extract,AAEE）、石油醚萃取相（petroleum ether in AAEE,AAEE-Pe）和乙酸乙酯萃取相（ethyl acetate in AAEE,AAEE-Ea）均可体内外显著抑制肝癌细胞的生长，提高H22肿瘤小鼠的存活率，且无毒副作用[9].为进一步探究中亚苦蒿发挥抗肿瘤活性的作用成分及广谱抑癌活性，本文首先将AAEE经AB-8大孔树脂进行分离纯化，获得中亚苦蒿大孔树脂85%乙醇洗脱相（85%ethanol elution fraction ofA.absinthiumL.ethanol extract with macroporous resin,AEMV），探究AEMV对人食管癌Eca109细胞的抑制作用及机理，为深入研究中亚苦蒿抗肿瘤作用成分和作用机制提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

人食管癌细胞株Eca109源于新疆大学生物资源与基因工程重点实验室.中亚苦蒿（A.absinthiumL.）购于爱丽康维吾尔医药科技有限公司佳秘康大药店，由新疆大学生命科学与技术学院逯永满老师鉴定.RPMI-1640、DMEM培养基、胎牛血清、磷酸缓冲液购于Gibco公司，双抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）和0.25%含EDTA Trypsin均购于MRC公司，0.22 μm有机滤器购于Millipore公司，DMSO、MTT购于Sigma公司，Annexin V-FITC/PI购于Yeasen公司；Hoechst 33258、ROS和∆Ψm检测试剂盒均购于Beyotime公司，caspases、PARP、cyt-c、cyclin B1、β-actin单克隆抗体购于Cell Signaling公司，GRP78、p-PERK、eIF-2α、p-eIF-2α购于Elabscience公司，Bax、Bcl-2、CHOP、HRP标记IgG购于Beyotime公司，其它试剂均为国产分析纯.

1.2 AEMV的制备

依据课题组前期纯化方案制备AAEE[9].将AAEE用灭菌水溶解成60 mg/mL，超声助溶，缓慢加入装有AB-8型大孔树脂的柱子里，用蒸馏水和不同浓度的乙醇（30%、50%、70%、85%）进行梯度洗脱，每个体系洗脱4个柱体积，收集85%乙醇洗脱相（萜类含量为57.16%，多糖含量为8.614%），旋蒸浓缩后冻干得到干粉，即为中亚苦蒿大孔树脂85%洗脱相，简称AEMV.用DMSO溶解成50 mg/mL，0.22 μm滤器过滤除菌，-20 ℃保存备用.

1.3 MTT法检测细胞增殖

将对数生长期的细胞以5×103个细胞/孔的浓度接种到96孔细胞培养板，24 h后采用AEMV（10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）和0.2% DMSO（阴性对照）处理细胞.设置untreated（0 μg/mL AEMV，未加入药物，仅加入相同体积培养基）为空白对照，30 μg/mL顺铂（cisplatin,cis）为阳性对照，每组设置6个重复.24 h后取出细胞培养板，1 200 rpm离心5 min，弃上清，每孔加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），37 ℃避光孵育3 h.3 h后，细胞培养板在1 200 rpm转速下离心7 min，弃上清，每孔加入200 μL DMSO将形成的甲臜晶体溶解.检测490 nm各孔的光密度值（OD490）.实验进行3次，细胞存活率计算公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD490/Control组OD490）×100%.

1.4 细胞凋亡检测

将Eca109细胞以2.5×105个细胞/皿培养在60 mm细胞培养皿中.24 h后分别用不同浓度（0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）的AEMV、0.2% DMSO和cisplatin处理细胞，24 h后收集各组细胞，PBS洗涤2次，弃上清，500 μL结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 碘化丙啶（PI），混匀后室温避光5 min.400目铜网过滤，转入流式管后经流式细胞仪（BD FACSCaliburTMFlow Cytometer,USA）检测.

1.5 Hoechst 33258染色

将不同浓度的AEMV、DMSO和cisplatin处理细胞24 h后，用预冷的PBS缓冲液冲洗3次，然后用预冷的4%多聚甲醛在4 ℃下固定细胞10 min，用预冷的PBS缓冲液冲洗3次，并用Hoechst 33258在4 ℃下避光染色10 min，倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti-E,Japan）观察样品.

1.6 细胞周期检测

PI用于分析细胞周期各阶段的DNA含量.采用流式细胞术进行细胞周期分析.细胞以2.5×105个细胞/皿的密度，在添加AEMV、DMSO的RPMI-1640培养基中培养24 h.收集细胞并用PBS洗涤，然后在4 ℃下用70%（v/v）预冷的乙醇固定30 min.用5 mL PBS洗涤2次，在37 ℃下用0.3 mL PI染色30 min后，通过流式细胞仪对样品进行检测.

1.7 细胞内活性氧（ROS）的检测

通过不同浓度的AEMV、DMSO和cisplatin处理细胞24 h，进行PBS洗涤，用10 μmol/L荧光探针2′,7′-dichloro-cluorescein diacetate（DCFH-DA）在37 ℃下避光染色20 min.PBS洗涤3次后，使用流式细胞仪检测细胞中的荧光强度.

1.8 线粒体膜电位（∆Ψm）的检测

通过不同浓度的AEMV、DMSO和cisplatin处理细胞24 h后收集细胞，PBS洗涤2次，用300 μL JC-1染色液重新悬浮细胞，在37 ℃下避光孵育30 min，再用PBS洗涤2次，使用流式细胞仪检测.

1.9 蛋白免疫印迹

通过不同浓度的AEMV、DMSO处理细胞24 h后，用预冷的PBS洗涤2次，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液冰浴提取总蛋白20 min.4 ℃、12 000 rpm离心15 min后，通过BCA蛋白质分析试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度.用12% SDS-PAGE分离相同浓度的蛋白质并转移到PVDF膜上.将膜用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，然后用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤，并在4 ℃下用适当稀释浓度的一抗过夜孵育.PBST洗涤3次，将膜与相应的耦合HRP的二抗在37 ℃下孵育2 h.PBST再洗涤3次，使用ECL分析试剂盒（Beyotime,China）检测目的蛋白的表达变化.

1.10 统计学分析

流式细胞仪（BD FACSCalibur,CA,USA）检测数据均由FlowJo 7.6软件分析完成.文中所有实验结果以“均数±标准差”表示，两组间均数比较用t检验，各组均数的比较采用单因素方差分析.P <0.01为差异极显著，P <0.05为差异显著，P >0.05为无显著差异.

2 实验结果

2.1 AEMV抑制人食管癌Eca109细胞增殖

为了检测AEMV对人食管癌Eca109细胞活性的影响，用不同浓度AEMV处理人食管癌Eca109细胞，24 h后采用倒置显微镜观察细胞形态（200倍）.如图1（a）所示，与对照DMSO组相比，经AEMV处理的细胞形态发生了明显变化，细胞发生皱缩，细胞数量显著减少.同时，MTT法检测结果如图1（b）所示，与对照DMSO组相比，经AEMV处理后，Eca109细胞存活率呈浓度依赖性下降（P <0.001），IC50值为57.76 μg/mL.结果表明AEMV可以显著抑制人食管癌Eca109细胞的增殖.

2.2 AEMV诱导Eca109细胞凋亡

为了探讨AEMV抑制Eca109细胞的增殖是否通过诱导细胞凋亡途径，用不同浓度AEMV处理Eca109细胞24 h，采用Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞术检测.与对照DMSO组相比，经AEMV处理的Eca109细胞的凋亡率显著升高（P <0.001），坏死率无显著变化（P >0.05）（图2）.

Hoechst 33258染色结果如图3所示.对照DMSO组染色着色均匀，而AEMV处理后的Eca109细胞的染色质呈现剂量依赖性固缩和断裂，这与cisplatin处理组的Eca109细胞类似.综上结果表明AEMV能够诱导Eca109细胞凋亡.

2.3 AEMV诱导Eca109细胞周期阻滞

AEMV能够抑制人食管癌Eca109细胞的生长并诱导细胞染色质固缩和断裂，因此，进一步检测AEMV是否通过诱导Eca109细胞周期阻滞来发挥作用.如图4所示，与对照DMSO组相比，50 μg/mL AEMV处理Eca109细胞24 h后，G0/G1期细胞数量显著增加（P <0.001），S期比例显著减少（P <0.001），阻滞细胞周期在G0/G1期.100 μg/mL AEMV处理Eca109细胞24 h后，可将细胞周期阻滞于G2/M期.为了阐明其机制，用Western Blot检测了细胞周期调节蛋白cyclin B1的表达变化，结果显示AEMV可下调cyclin B1的表达，表明AEMV能够通过阻滞细胞周期抑制Eca109细胞生长.

2.4 AEMV诱导Eca109细胞产生ROS

ROS的产生和累积可以诱导细胞凋亡[10].DCFH-DA是一种细胞通透性的染料，它可以自由穿过细胞膜，在细胞内被酯酶水解生成DCFH.细胞内的活性氧可以将无荧光的DCFH氧化为有荧光的DCF.因此DCF的荧光强度可以间接反应细胞内活性氧的水平.我们检测了AEMV处理24 h后Eca109细胞内ROS水平的变化.如图5所示，100 μg/mL AEMV可以诱导ROS产生，说明AEMV诱导的细胞凋亡部分依赖于ROS的生成.

2.5 AEMV导致Eca109细胞线粒体膜电位（∆Ψm）下降

大量的ROS累积可导致细胞∆Ψm的降低，进而诱导线粒体依赖性凋亡[11].为了探究AEMV介导的细胞凋亡是否通过线粒体依赖途径，通过JC-1探针检测∆Ψm的变化.当∆Ψm较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；当∆Ψm较低时，JC-1转变为单体，产生绿色荧光.如图6（a）所示，AEMV可诱导Eca109细胞∆Ψm下降.

线粒体膜的完整性与Bcl-2蛋白家族成员Bax和Bcl-2的蛋白表达密切相关.用Western Blot检测AEMV处理Eca109细胞24 h后Bax和Bcl-2蛋白表达水平的变化.如图6（b）所示，AEMV处理后上调了促凋亡蛋白Bax的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.与对照DMSO组相比，AEMV处理后Bax/Bcl-2的比值和cyt-c的表达量升高，表明AEMV可通过降低Eca109细胞∆Ψm、促进cyt-c的释放，从而诱导细胞凋亡.

2.6 AEMV激活caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导Eca109细胞凋亡

为了探讨AEMV诱导Eca109细胞凋亡是否与caspase的激活相关，用Western Blot检测了caspase通路相关蛋白的表达变化.如图7所示，AEMV处理Eca109细胞24 h后，剂量依赖性地增加caspase-9、caspase-3和PARP的剪切，表明AEMV可能通过caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导Eca109细胞凋亡.

2.7 AEMV通过内质网应激途径诱导细胞凋亡

内质网应激通路的激活与线粒体凋亡途径密切相关[12−13].为了进一步探究AEMV诱导的Eca109细胞凋亡是否与内质网应激通路的激活相关，用Western Blot检测了内质网应激通路相关蛋白的表达变化.实验结果显示AEMV处理Eca109细胞后可显著上调葡萄糖调节蛋白GRP78的表达，从而促进PERK和eIF-2α的磷酸化，导致促凋亡蛋白CHOP的表达量增加（图8），表明AEMV可通过诱导内质网应激信号通路诱导Eca109细胞凋亡.

3 分析与讨论

食管癌是一种高发病率和死亡率的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康，其发生发展与多基因相关，多种途径共同参与这一过程.食管癌死亡率较高、治疗难度大，从天然产物中筛选抗肿瘤药物已成为研究热点[14−15].本课题组前期研究发现中亚苦蒿醇提物AAEE具有较强的抗肿瘤作用[9]，为进一步追踪活性组分，本文通过AB-8大孔树脂对AAEE进行分离纯化，获得中亚苦蒿大孔树脂85%乙醇洗脱相AEMV，实验结果表明AEMV能通过诱导细胞凋亡显著抑制人食管癌Eca109细胞的增殖（P <0.001）.Kim等[16]发现从茵陈蒿的干叶中提取的乙醇组分（LAC117）可通过caspase-3裂解和线粒体膜电位降低XIAP的表达，增加细胞色素c的释放、PARP的裂解诱导细胞凋亡来抑制人HCC细胞系HepG2和Huh7的增殖.Kim等[17]研究发现黄花蒿提取物（AEE）通过增加LDH释放，激活caspase-3和caspase-7，降低线粒体膜电位，促进细胞色素c释放和Bax转位体外抑制HCT116结肠癌细胞增殖.

细胞凋亡或细胞程序性死亡在所有疾病的生物学过程中起着至关重要的作用，被认为是癌症治疗的重要靶点[18].通过激活外源性（死亡受体介导的）和内源性（线粒体介导的）途径，诱导细胞凋亡[19].这两种凋亡途径中，caspases家族是关键靶点.Procaspase-8在外源途径中被膜相关蛋白复合物（Fas-L/TNF）激活，而Procaspase-9在内源途径中被线粒体相关蛋白激活.然后，Procaspase-3在两条途径的汇合点被激活，随后被切割的caspase-3的靶蛋白（PARP蛋白）激活.本文中，与对照DMSO组相比，AEMV处理Eca109细胞可剂量依赖性地增加caspase-9、caspase-3和PARP的剪切，表明AEMV可通过caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导Eca109细胞凋亡.

线粒体途径主要是通过调节线粒体膜的通透性影响下游分子从而调节细胞凋亡[20].Bcl-2家族的主要功能是介导线粒体外膜的通透性，这是内源性凋亡途径中最重要的事件[21−23].Bcl-2家族根据其结构和功能的不同，可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，所有家族成员都具有高度保守的Bcl-2同源结构域[24].Bcl-2家族的抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w.Bcl-2通过其羧基端疏水跨膜结构域辅助蛋白质定位于线粒体外膜[25].Bax、Bak和Bok属于促凋亡Bcl-2家族[26]，Bax和Bak可通过改变线粒体膜的通透性，释放细胞色素c来介导caspase-9的激活，导致caspases的级联反应被触发，激活caspase-3，从而导致细胞凋亡[27].本文中，AEMV处理后上调了促凋亡蛋白Bax的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时cyt-c的表达量升高，表明AEMV可通过降低Eca109细胞∆Ψm、促进cyt-c的释放，诱导细胞凋亡.

ROS是高活性氧自由基或非自由基分子，在决定细胞命运中起着重要作用，细胞内ROS的积累可激活凋亡信号通路[28−29].本文中，100 μg/mL AEMV可以诱导ROS产生，说明AEMV诱导的细胞凋亡部分依赖于ROS的生成.未折叠/错误折叠的蛋白质和脂质的异常积累或内质网Ca2+稳态的突然变化均会导致细胞适应性反应，称为内质网应激.然而，过度内质网应激被认为与氧化应激和线粒体功能障碍密切相关，可诱导细胞凋亡[30−31].最近的研究已经证实，药物诱导的活性氧生成增加、细胞内钙离子和内质网应激的激活可诱导癌细胞线粒体凋亡[32−34].因此，我们进一步检测了AEMV处理Eca109细胞后内质网应激相关蛋白的表达变化，实验结果表明AEMV可显著上调葡萄糖调节蛋白GRP78的表达，促进PERK和eIF-2α的磷酸化，导致促凋亡蛋白CHOP的表达量增加，表明细胞内ROS可能参与AEMV诱导的Eca109细胞内质网应激和细胞凋亡.

4 结论

中亚苦蒿大孔树脂85%乙醇洗脱相AEMV可浓度依赖性显著抑制人食管癌Eca109细胞的增殖，阻滞Eca109细胞周期，通过诱导胞内活性氧水平升高、线粒体膜电位下降，激活线粒体依赖性凋亡途径和内质网应激途径诱导Eca109细胞凋亡.今后，将对抗癌的有效成分AEMV进行进一步分离纯化并探究活性成分的构效关系与作用靶点，为抗食管癌药物的深入研究提供基础依据.