干热河谷不同树龄攀枝花苏铁丛枝菌根真菌多样性研究

魏玉倩，陈健鑫，郑艳玲，王 芳，马焕成*，伍建榕

(1.西南林业大学 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 国家林业和草原局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224)

攀枝花地区是典型的干热河谷地区，位于26°51′32″N,101°34′46″E，四川省最南部，地处攀西裂谷中南段，夏季长，旱季雨季分明昼夜温差大，气候干燥，降雨量集中在雨季[1]。攀枝花苏铁国家级自然保护区位于金沙江北岸的巴关河西坡及格里坪后山，属于典型的南亚热带半干旱河谷气候类型，冬季气候温和，日照充沛，热量丰富[2]。该地区地势陡峭、河谷深切、地形封闭[3]。金沙江干热河谷森林覆盖率不足5%，生态环境恶劣，水土流失严重，植物难以在该地区建立长期稳定的种群。

攀枝花苏铁(Cycaspanzhihuaensis)是中国特有的古老孑遗植物，与熊猫、恐龙合称为“巴蜀三宝”,生存时间长达2亿a以上[4]。攀枝花苏铁最初发现于攀枝花市附近的巴关河西坡，继而在毗邻的格里坪后山及宁南、德昌、盐源和云南华坪等县的局部地区也有发现，是苏铁属在东亚大陆分布纬度最北的种类。攀枝花苏铁能适应干旱河谷的特殊生境能在河谷岩壁的石缝中建立自己的种群[5]，为适应外界不良的环境，攀枝花苏铁与土壤微生物建立共生关系，进化出了特殊的根系，包括主根、侧根和特化的珊瑚状根。目前对苏铁特殊根系的研究主要集中在由共生蓝藻形成的珊瑚状根上，大多数研究者认为共生蓝藻通过根系的裂缝、水孔、根系顶端及根系分支处开始侵染并延伸至藻胞层定殖[6-8]。研究指出攀枝花苏铁根系内生菌有较高的多样性，Zheng Y等[9]利用高通量技术对攀枝花苏铁不同组织和根际土壤中微生物物种多样性和群落组成进行分析表明，不同组织中的微生物群落均有高度的多样性；研究表明自然生态系统中菌根真菌影响植物种群的竞争能力，菌根真菌的多样性决定着植物的生物多样性、生态系统的变化以及植物的生产力[10]。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)隶属于球囊菌门(Glomeromycota)的一类专性活体营养共生菌，能与陆地生态系统约80%以上的高等植物形成互惠共生体，通过共生体AMF能促进植物对N、P、K等矿物质元素及微量元素的吸收和利用，增强植物的抗旱、抗寒和盐胁迫等的抗逆性，促进植物生长、加快幼苗成活、促进农林业发展，对生物多样性的维持和生态系统稳定具有重要的作用[11-12]。AMF主要以菌丝网和孢子的形式定殖于植物根际土壤中，同时以丛枝和泡囊的结构共生于植物根系中[13]，有文献报道，苏铁与AMF也存在共生关系，B.Jack和P.Andrew[14]在南美苏铁(Zamiapumila)和双子铁(Dioonedule)中描述了存在于根系皮层薄壁细胞的AMF，并提出了当土壤P元素含量受限时，苏铁需要AMF才能成功地固N，但攀枝花苏铁中是否有AMF定殖还未见报道。

本课题组前期研究发现，生长于干旱贫瘠土壤的攀枝花苏铁根系土壤有大量的AMF孢子，然而对不同树龄的AMF定殖情况及群落组成鲜见报道。本研究以不同树龄的攀枝花苏铁根系及根际土壤为研究对象，从攀枝花苏铁根际土壤中分离AMF孢子，通过形态学特征和分子生物学方法进行种类鉴定，并通过醋酸墨水染色法观察AMF的定殖情况及计算定殖率，统计分析不同树龄的攀枝花苏铁根内及根际土壤中AMF种类及多样性的变化趋势，旨在为攀枝花苏铁菌根化育苗栽培及保育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2018年7月在四川省攀枝花市攀枝花苏铁国家级自然保护区内，采用五点取样法[15]，在每点分别采取8株14 a、8 a和3 a树龄的攀枝花苏铁植株，每个植株在东西南北4个方位采集苏铁根系及土样。取根样时，先用75%乙醇擦拭枝剪，快速剪取须根后保存于FAA固定液中，同时挖取苏铁根际土壤，采集距地表5～20 cm的根际土壤1 000 g，装入无菌塑料袋，带回实验室进行后续试验。

1.2 根系AMF定殖率的测定

采用醋酸墨水染色方法观察攀枝花根系菌根真菌定殖状况。将根样从FAA固定液中取出，流水缓慢冲洗2～3次后将根系剪成1 cm长的根段，然后将根样置于20% KOH中透明，置于5%醋酸中酸化，用5%醋酸墨水染色液染色，最后用清水浸泡脱色后即可镜检[16]。每个样品采集50个根段，计算根段定殖率。

根段定殖率参照唐燕等[17]的方法，将AMF定殖强度划分为强、中、弱3级，强定殖率为76%～100%，中定殖率为25%～75%，弱定殖率为0～24%。根段侵染率的计算公式如下：

根段定殖率(%)=∑(0×根段数+10%×根段数+……+100%×根段数)/总根段数

(1)

1.3 AMF孢子的分离与密度统计

采用湿筛沉淀法[18]分离土壤中AMF孢子。称取风干土样20 g置于250 mL广口瓶中，将水加至200 mL，用玻璃棒将其充分搅拌混匀，静置过夜，制备成土壤悬浮液。将悬浮液分别过20、100、140、200、300目的土壤筛，用自来水反复轻柔清洗，直至筛底流出的水澄清为止，将筛面筛出的物质全部转移至烧杯中，加水至200 mL，静置20 min后转入梨形分液漏斗进行沉降除沙，分液漏斗中静置20 min后，打开活塞，待分液漏斗中所剩溶液为100 mL时，关闭活塞，所得的孢子悬浮液用布氏漏斗进行过滤，经真空抽气泵抽气于直径为9 cm的垫有滤纸的培养皿上，20目的不过滤。并在体式显微镜下分别计数各筛面的孢子数目，统计每克土样中含有的AMF孢子的数量计为AMF孢子密度[19]。

1.4 AMF孢子的鉴定

形态学鉴定方法：挑取单个AMF孢子置于载玻片上，通过光学显微镜观察并拍照记录，重点观察孢子大小、形状、颜色、连孢菌丝、孢子壁及发芽壁的层数和厚度、孢子压破后的内含物等特征。根据SCHENCK和PEREZ的《VA菌根真菌鉴定手册》和INVAM(http://invam.caf.wvu.edu)提供的种的描述的图片进行种属的检索和鉴定，并将数量及相对多度较高的种计为优势种属。

分子生物学鉴定方法：采用OMEGA公司MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒提取单孢子总DNA，参照李小林等[20]的方法，通过巢式PCR扩增AMF 18SrDNA片段。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，正确的扩增产物送昆明擎科生物有限公司进行测序。双向测通的序列通过DNAman进行拼接并去除两端低质量序列，通过MEGA 6.0中的邻接法构建系统发育树，依此确定菌株的分类地位。

1.5 攀枝花苏铁AMF多样性及不同树龄间的差异分析

参照包玉英等[21]的方法，采用孢子密度、物种丰富度、优势度、Shannon-Wiener多样性指数和Simpson生态优势度来描述攀枝花苏铁AMF多样性，同时分析14年生、8年生和3年生攀枝花苏铁AMF的差异性。采用Excel统计试验数据，并使用SPSS22.0软件分析不同树龄之间的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 攀枝花苏铁根系AMF定殖情况

攀枝花苏铁根系染色后的样本在光学显微镜下可见AMF侵染与定殖情况(图1)，其中菌丝、泡囊是根系内AMF的主要结构。

通过表1数据统计分析，结果表明，不同树龄攀枝花苏铁的根系AMF定殖情况存在一定差异，14年生攀枝花苏铁根系的AMF定殖率最高，达到高定殖强度，定殖结构以泡囊为主(图1a、图1b)；8年生根系AMF定殖率中等，为中定殖强度，定殖结构以泡囊和菌丝为主(图1c、图1d)；3年生的AMF定殖率较低，为弱定殖强度，定殖结构以菌丝为主，泡囊结构较少(图1e、图1f)。

注:a、b为14年生攀枝花苏铁；c、d为8年生攀枝花苏铁；e、f为3年生攀枝花苏铁；V为泡囊；H为菌丝；标尺=20 μm。图1 攀枝花苏铁根系AMF形态Fig.1 Morphology of AMF in roots of Cycas panzhihuaensis

表1 不同树龄的攀枝花苏铁AMF的定殖情况Table 1 The colonization of AMF in Cycas panzhihuaensis trees with different ages %

2.2 不同树龄阶段的攀枝花苏铁AM真菌的鉴定

基于形态学特征鉴定，攀枝花苏铁根际土壤中共分离、鉴定得到6属22种的AMF孢子(图2)，包括球囊霉属(Glomus)、无梗囊霉属(Acaulospora)、近明球囊霉属(Claroideoglomus)、斗管囊霉属(Funneliforms)、盾巨孢囊霉属 (Scutellospora)、硬囊霉属(Sclerocystis)。球囊霉属和无梗囊霉属为攀枝花苏铁根际AMF的优势属，相对多度分别为56.91%和28.23%。

注:1.黑球囊霉；2.澳大利亚球囊霉；3.蜜色无梗囊霉；4.双网无梗囊霉；5.黑色盾巨孢囊霉；6.团集球囊霉7.网状球囊霉；8.近明球囊霉；9.斑点球囊霉10.多梗球囊霉；11.膨果球囊霉；12.地表球囊霉；13.地球囊霉；14.缩球囊霉；15.卷曲球囊霉；16.小果球囊霉；17.黑球囊霉；18.明球囊霉；19.双网无梗囊霉；20.细凹无梗囊霉；21.幼套近明球囊霉；22.台湾硬囊霉。图2 攀枝花苏铁根际土壤丛枝菌根真菌孢子形态Fig.2 The morphology of AMF spores in rhizospheric soils of Cycas panzhihuaensis

由表2可见，3年生攀枝花苏铁根系中共鉴定出AMF 3属，包括球囊霉属、无梗囊霉属和盾巨孢囊霉属。特有菌种为澳大利亚球囊霉(G.australe)、蜜色无梗囊霉(A.mellea)、黑色盾巨孢囊霉(S.nigra)；8年生苏铁根系中共鉴定出AMF 4属，包括球囊霉属、无梗囊霉属、近明球囊霉属和硬囊霉属。特有菌种为皱壁无梗囊霉(A.rugosa)；14年生苏铁根系中共鉴定出AMF 5属，包括球囊霉属、无梗囊霉属、近明球囊霉属、硬囊霉属和斗管囊霉属，特有菌种为细凹无梗囊霉(A.scrobiculata)、幼套近明球囊霉(C.ctunicatum)、摩西斗管囊霉(F.mosseae)。

表2 不同树龄的攀枝花苏铁根际土壤中AMF孢子种类组成Table 2 The community of AMF in rhizophere soil of Cycas panzhihuaensis with different ages

基于分子生物学方法，扩增了AMF单孢子18SrRNA片段，通过邻接法构建了系统发育树(图3)，共鉴定了9种AMF孢子，包括3年攀枝花苏铁AMF孢子2种，8年生攀枝花苏铁AMF孢子2种及14年生攀枝花苏铁AMF孢子5种。

图3 基于18Sr RNA构建的系统发育树Fig.3 A phylogenetic tree developed by 18sr RNA gene

2.3 不同树龄的攀枝花苏铁AMF多样性及相关性分析

由表3可知，攀枝花苏铁AMF侵染率随年龄增长呈现增加的趋势，14年生攀枝花苏铁根际土壤AMF孢子密度为16.02个/g，8年生攀枝花苏铁根际土壤孢子密度为14.13个/g，3年生攀枝花苏铁根际土壤孢子密度为13.3个/g，结果表明AMF孢子密度也随树龄的增加呈现递增的趋势。

表3 不同树龄攀枝花苏铁AMF定殖率与AMF孢子密度的相关性Table 3 The correlation betweenthe colonization rate and spore density of AMF in Cycas panzhihuaensis trees with different ages

通过菌根定殖率与孢子密度的相关性分析，得到二者之间的相关性是0.873 9，呈显著的正相关关系。由此得出，随着树龄增加，菌根真菌定殖率、孢子密度、丰富度和多样性指数均能够增加。

3 结论与讨论

在陆地生态系统中，土壤微生物能够影响植物生长、群落组成和种类多样性，同时陆地植物也会影响土壤微生物生态系统，两者形成动态相互作用的关系[22]。当宿主植物发生改变时，土壤中的AM真菌种类和数量也会发生改变。本研究对干热河谷攀枝花苏铁自然保护区的不同树龄的攀枝花苏铁根际土壤AM真菌进行分离、物种鉴定以及菌根定殖进行分析后发现，土壤AMF定殖率、孢子密度、多样性指数与树龄密切相关，首次报道了AMF在宿主苏铁中的定殖率和多样性，填补了空白。

本研究中，3年生、8年生和14年生的攀枝花苏铁AMF定殖率分别为21.10%、28.54%和36.13%，孢子密度分别为13.3、14.13个/g和16.02个/g，说明苏铁种植8 a就达到了较稳定的菌根真菌定殖率，这与树龄越大，抗逆性越强是一致的。大量研究结果表明，AMF定殖率及群落组成受到生态环境中的气候和土壤条件影响很大[23]，同时也受到植株年龄的影响[24]。研究发现，不同生长年龄的攀枝花苏根际土壤中AMF种类存在差异，14年生攀枝花苏铁孢子密度最高，且分离出的AMF种类也最多，鉴定出16个种的AMF；8年生的次之，共鉴定出14个种的AMF；而3年生攀枝花苏铁只有6个种的AMF。究其原因，一方面可能是因为AMF能够促进宿主植物对土壤养分等的吸收，促进植物生长；另一方面宿主植物能够为AMF提供碳水化合物，与之互惠共生的AMF属的数目也相对增加[25]。这在一定程度上表明树龄越长，越能够为AMF提供更适宜的生存和繁殖条件，不同的树龄，随生物量增加，AMF多样性丰富，定殖率增高，抵抗不良环境，改善环境条件，土壤AMF多样性增加，增加P的吸收，增加固N作用，生物量增加。同时AMF对提高苗木和植物的总生物量、总根长、根表面积、根投影面积和根体积具有积极作用。树木能长出更多的根，通过根直径的函数改变根系增殖，以增加植物营养中选择性觅食的能力[26]。通过与植物形成共生体，AMF可以改变植物根系形态，主要增加根系生物量，从而提高根系觅食和吸收养分的能力，进而改变植物的整体生长潜力。不同树龄的攀枝花苏铁土壤中，球囊霉属的AMF相对丰度较高，这可能是因为球囊霉属具有较强的环境适应能力和独特的繁殖特性[27]，较高的产孢率能够使其在不同环境中定殖，因此分布广泛。而3年生攀枝花苏铁中无梗囊霉属相对丰度高于14年生攀枝花苏铁，无梗囊霉属的AMF往往在酸性环境条件下的土壤中具有较高的产孢率[28]。

AM真菌的分离鉴定是保护以及利用微生物资源最基本也是最重要的工作。AM真菌几乎可以存在于土壤中任何地方，且有丰富的物种多样性。近年来，有关AM真菌物种多样性研究越来越多，下一步试验中希望通过探究土壤理化性质，从而了解土壤与AMF之间的相关性。通过完善植物AM真菌的种质资源调查，对筛选高效菌种以及农林业菌根真菌资源的开发和应用具有重要的意义。