桂花新品种‘胭脂红’不同发育阶段花瓣非靶向代谢组学分析

柴子涵，张 敏，李 岚，张 成，段一凡*

(1.南京林业大学 生物与环境学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.木犀属植物栽培品种国际登录中心，江苏 南京 210037)

桂花学名木犀(Osmanthusfragrans)，隶属于木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)，既是优良的园林绿化树种，也是著名的香花植物[1]。桂花是我国传统十大名花之一，有着2 500 a以上的栽培历史[2]。在长期的栽培过程中，人们选育出了丰富的桂花品种。前人根据花期、花色、结籽与否、叶色等观赏性状特征，将桂花分为5大品种群：四季桂品种群(Asiaticus Group)、银桂品种群(Albus Group)、金桂品种群(Luteus Group)、丹桂品种群(Aurantiacus Group)以及彩叶桂品种群(Colour Group)[3-4]。虽然在长期的驯化过程中，桂花形成了黄白色—黄色—橙黄色的不同颜色梯度的品种，但颜色较为单一，缺少其他色系的品种[5]。2014年桂花新品种‘胭脂红’通过木犀属植物栽培品种国际登录中心的实质审查，该品种初开时呈淡黄色，后逐渐呈胭脂红色[6]。因其独特的花色，‘胭脂红’填补了红色系桂花品种的空白。

代谢组学是研究生物体某阶段各种小分子代谢产物变化的理想技术手段，主要可以分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学[7]。靶向代谢组学利用前期建立的代谢物数据库，可以对目标代谢物进行绝对定量分析[8]。虽然靶向代谢组学有着准确度高、特异性强的特点，但非靶向代谢组学可以全面分析生物体内代谢物的种类，无差别筛选代谢物，最终可以最大限度和最大范围检测生物体中的代谢物变化情况[9]。因此，本研究以不同发育阶段的‘胭脂红’花瓣为材料，利用非靶向代谢组学分析其代谢物种类和含量的时序性变化，以期探寻该品种所含特殊的代谢物及其合成积累规律，为挖掘‘胭脂红’的潜在价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

‘胭脂红’采自浙江省金华市华安园林苗木基地(119°38′42.57″E，28°58′15.51″N)。根据花瓣的外部特征和颜色变化，确定了3个具有代表性的发育阶段(图1)。采集初花期(S1)、盛花期(S2)和末花期(S3)花瓣，液氮速冻后-80 ℃保存，每个发育阶段样品重复3次。

注：A.初花期(S1)；B.盛花期(S2)；C.末花期(S3)。图1 不同发育阶段‘胭脂红’Fig.1 Different developmental phases of Osmanthus fragrans‘Yanzhi Hong’

1.2 代谢物提取方法

首先将样品冷冻干燥处理，利用SCIENTZ-48组织研磨仪(新芝，中国)进行研磨(55 Hz，60 s)；精确称量100 mg研磨后的样本至2 mL EP管中，加入0.6 mL含内标的甲醇(67-56-1，99.0%，Thermo Fisher)，涡旋振荡30 s；冰水浴中超声15 min，4 ℃过夜后，4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min；取上清液，0.22 μm膜过滤后进行LC-MS上机检测[10]。

1.3 上机检测及相关参数设置

使用UltiMate 3 000液相色谱仪(Thermo Fisher，美国)对样品进行分离。色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm(2.1×150 mm)色谱柱(Waters，美国)，柱温设为40 ℃，自动进样器温度设为8 ℃，进样体积为2 μL。正离子流动相A为体积分数0.1%的甲酸(64-18-6，LC-MS级，TCI)—水溶液，流动相B为体积分数0.1%的甲酸—乙腈(75-05-8，99.9%，Thermo Fisher)溶液；负离子流动相A为5 mmol/L甲酸铵(540-69-2，99.9%，Sigma)—水溶液，流动相B为乙腈[11]。

使用Q Exactive Plus质谱仪(Thermo Fisher，美国)进行质谱数据采集。正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV。毛细管温度为325 ℃，以分辨率70 000进行全扫描，扫描范围为81～1 000。采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息[12]。

1.4 数据预分析

通过Proteowizar(v3.0.8789)将获得的原始质谱数据转成mzXML格式，使用R(v4.1)的XCMS包进行峰识别、峰过滤和峰对齐等处理，主要参数设定为bw=2、ppm=15、peakwidth=c(5,30)、mzwid=0.015、mzdiff=0.01、method=centWave[13]。

1.5 代谢物相对定量与鉴定

本研究基于UPLC/HRMS进行代谢组学的相对定量分析。该方法首先获取标准曲线校正溶液和样本溶液的原始质谱数据，然后计算标准曲线校正样品和正负离子模式下鉴定到的同位素峰面积，并与标准曲线的校正浓度进行线性拟合，优选线性方程和同位素内标。再将样本中代谢物峰面积与标准曲线校正溶液中优选的同位素内标峰面积的比值，代入优选的线性方程，计算样本中代谢物的相对定量浓度。将代谢物精确分子量，以及MS/MS模式所得碎片信息在Metlin(http://metlin.scripps.edu)、MoNA(https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu)和自建标准品数据库中进一步匹配注释，获得代谢物准确信息[14]。

1.6 数据分析

依据不同阶段代谢物的相对含量，使用R(v4.1)的Mfuzz包对代谢物进行聚类分析[15]。利用KEGG(http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html)和R(v4.1)的ggplot2包对代谢物进行KEGG富集分析[16-17]。使用Excel 2016对数据进行整理，使用SPSS(v23.0)对数据进行ANOVA分析。

2 结果与分析

2.1 ‘胭脂红’不同发育阶段代谢物种类

经过筛选，正离子模式共获得5 519个前体分子，负离子模式共获得7 010个前体分子。共注释到304个代谢物，包括64种醇和多元醇、9种苯二酚、15种单萜类化合物、15种二元羧酸及其衍生物、18种吡啶甲酸及其衍生物、64种氨基酸、18种羰基化合物、37种脂肪酸及其复合物、46种碳水化合物及其复合物和18种苯甲酸及其衍生物。

2.2 ‘胭脂红’不同发育阶段代谢物聚类分析

为了进一步分析‘胭脂红’发育过程中代谢物的相对含量变化，本研究对所注释到的代谢物进行聚类分析，具有相同积累规律的代谢物会被聚到同一个簇中(图2)。所有的代谢物被聚成9个簇，大致可以分为4种类型：持续上调(Cluster 6、Cluster 9)、持续下调(Cluster 8)、先上调后下调(Cluster 3、Cluster 5、Cluster 7)、先下调后上调(Cluster 1、Cluster 2、Cluster 4)。

注：S1.初花期；S2.盛花期；S3.末花期。图2 ‘胭脂红’不同发育阶段代谢物聚类图Fig.2 Clustering map of metabolites in different developmental phases of ‘Yanzhi Hong’

Cluster 6显示，24个代谢物的相对含量在开花过程中呈现上升趋势，且S1时期至S2时期的上升趋势明显，S2时期至S3时期的上升趋势平缓。其中，相对含量较高的代谢物有3-羟基苯乙酸、3-羟基丁酸、L-酪氨酸和山楂酸等。Cluster 9显示，42个代谢物的相对含量在开花过程中呈现上升趋势，且S1时期到S2时期的上升趋势平缓，S2时期到S3时期的上升趋势明显。其中，相对含量较高的代谢物有2-脱氢-3-脱氧-D-阿拉伯糖酸、D-木糖醇、异丁酸、L-2-羟基戊二酸和柠檬酸等。

Cluster 8显示，41种代谢物的相对含量在开花过程中呈现下降趋势，S2时期至S3时期的下降趋势较S1至S2时期幅度大。其中，相对含量较高的代谢物有琥珀酸、乙基丙二酸、茉莉酮酸甲酯、3-甲基-2-氧代戊酸、马来酸、β-谷甾醇、红景天苷、苦杏仁苷、咖啡酸和长叶薄荷酮等；该簇包含红景天苷和苦杏仁苷等环烯醚萜。

Cluster 3显示，32种代谢物的相对含量在开花过程中呈现先下降后上升趋势，且代谢物在S3时期相对含量最高。其中，相对含量较高的代谢物有紫苏醇、γ-氨基丁酸、庚二酸、肉豆蔻酸和鼠尾草酚等；该簇包含连翘酯苷E和5-O-甲基维斯阿米醇苷等环烯醚萜。Cluster 5显示，34种代谢物的相对含量在开花过程中呈现先下降后上升趋势，且代谢物在S3时期相对含量最高。其中，相对含量较高的代谢物有D-果糖、苯乙酸、反式-肉桂酸、氧化柠檬烯、乙酸苯酯、柠檬酸和月桂酸等。Cluster 7显示，28种代谢物的相对含量在开花过程中呈现先下降后上升趋势，且代谢物在S1时期相对含量最高。其中，相对含量较高的代谢物有β-丙氨酸、焦谷氨酸、氧戊二酸、己二酸二辛酯、琥珀酸半醛、3-氨基戊二酸、富马酸和连翘酯苷等，该簇包含连翘酯苷和大车前苷等环烯醚萜。

Cluster 1显示，36种代谢物的相对含量在开花过程中呈现先上升后下降趋势，且S3时期代谢物的相对含量较S1时期高。其中，相对含量较高的代谢物有异缬草酸、3-脱氢莽草酸甲酯、桃叶珊瑚苷和棕榈酸等；该簇包含桃叶珊瑚苷这一环烯醚萜。Cluster 2显示，37种代谢物的相对含量在开花过程中呈现先上升后下降趋势，且S1时期代谢物的相对含量与S3时期相对持平。其中，相对含量较高的代谢物有、L-异亮氨酸、3-甲基-2-氧戊酸、L-赖氨酸、4-羟基肉桂酸、吲哚丙酮酸、甜菜碱和绿原酸等。Cluster 4显示，29种代谢物的相对含量在开花过程中呈现先上升后下降趋势，S1时期至S2时期的上升趋势平缓，但S2时期至S3时期的下降趋势明显。其中，相对含量较高的代谢物有3,4-二羟基苯基丙酸酯、醉椒素、薄荷酮、金雀异黄酮和硬脂酸等；该簇包含金雀异黄酮这一黄酮类物质。

2.3 不同聚类代谢物的代谢通路分析

利用 KEGG 数据库信息来分析‘胭脂红’不同聚类代谢物所在的生物学通路。持续上调的聚类中，Cluster 6中的代谢物共映射到35条代谢通路，其中富集程度显著的有苯丙氨酸代谢途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径(图3-A)。Cluster 9富集程度显著的有抗坏血酸和藻酸盐代谢途径以及乙醛酸和二羧酸的代谢途径。持续下调的聚类中，Cluster 8中的代谢物共映射到30条代谢通路，其中富集程度显著的有丁酸甲酯代谢途径，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径以及柠檬酸循环(TCA循环)途径(图3-B)。先下调后上调的聚类中，Cluster 3中富集程度显著的有甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径；Cluster 5中富集程度显著的有苯丙氨酸代谢途径和α-亚麻酸的代谢途径；Cluster 7中的代谢物共映射到19条代谢通路，其中富集程度显著的有丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，嘧啶代谢途径以及酪氨酸代谢途径(图3-C)。先上调后下调的聚类中，Cluster 1中富集程度显著的有戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化途径以及光合生物中的碳固定途径；Cluster 2中富集程度显著的有β-丙氨酸代谢途径；Cluster 4中的代谢物共映射到22条代谢通路，其中富集程度显著的为类单萜的生物合成途径(图3-D)。

注：A.Cluster 6；B.Cluster 8；C.Cluster 7；D.Cluster 4；点的大小代表代谢物个数，颜色代表P值。图3 不同聚类中代谢物的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of metabolites in different clusters

2.4 ‘胭脂红’不同发育阶段香气成分分析

桂花是重要的木本香花植物，而‘胭脂红’有着独特的香气，所以本研究也特别关注了其香气成分在不同发育阶段的动态变化。所测代谢物中共有34种与花香有关的香气成分(表1)，主要分为醇类、酮类、萜烯类、酸类和酯类等。各类香气成分的种类在不同发育阶段的差异较小，但是相对含量有着显著差异。

表1 不同发育阶段香气成分的相对含量Table 2 Relative content of aroma components in different developmental phases %

‘胭脂红’在不同发育阶段香气成分的相对含量不同。S1时期检测出的香气成分相对含量最高的是紫苏醇，较高的有3,4-二羟基苯丙酸酯、茉莉酮酸甲酯、香叶酸、己二酸二乙基己酯和胡薄荷酮；S2时期检测出的香气成分相对含量最高的是紫苏醇，较高的有3,4-二羟基苯丙酸酯、4-羟基苯甲酸酯、茉莉酮酸甲酯和顺式-己二烯二酸酯；S3时期检测出的香气成分相对含量最高的是紫苏醇，较高的有香叶酸和10-氧癸酸酯。整体来看，相对含量最高的香气成分是紫苏醇，较高的有3,4-二羟基苯丙酸酯、香叶酸、茉莉酮酸甲酯、顺式-己二烯二酸酯和氧化柠檬烯等。

不同香气成分的相对含量积累规律也有很大区别。紫苏醇、香叶酸、鼠尾草酚、肉豆蔻酸、10-羟基硬脂酸、氧化柠檬烯、乙酸苯酯、月桂酸和反式-肉桂酸等的相对含量先降低再升高；顺式-己二烯二酸酯、棕榈酸、石竹烯α-氧化物、L-香芹酮、L-薄荷酮、硬脂酸和γ-萜品烯等的相对含量先升高再降低；茉莉酮酸甲酯、胡薄荷酮、咖啡酸和亚麻酸等的相对含量不断降低；只有10-氧癸酸酯的相对含量在发育过程中持续升高。

3 结论与讨论

本研究基于非靶向代谢组，解析了‘胭脂红’花瓣在初花期、盛花期和末花期3个阶段的代谢组学动态变化规律。通过代谢物定性定量分析和聚类分析，首次在桂花中检测到了6种环烯醚萜和1种黄酮，且具有很高的药用价值。共测得34种香气成分，含量最高的是紫苏醇，其次是3,4-二羟基苯丙酸酯、香叶酸和茉莉酮酸甲酯等。对不同聚类中的代谢物进行富集分析，富集到与花香有关的苯丙氨酸代谢途径和α-亚麻酸代谢途径，以及与花色有关的单萜生物合成途径。

通过聚类分析，大致将代谢物的时序性变化归为4类：持续上调、持续下调、先上调后下调和先下调后上调。本研究首次在桂花中检测到了6种环烯醚萜和1种黄酮，包括苦杏仁苷、连翘酯苷E、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘酯苷、大车前苷、桃叶珊瑚苷和金雀异黄酮。从S1到S3，苦杏仁苷的相对含量逐渐降低，连翘酯苷E、5-O-甲基维斯阿米醇苷、连翘酯苷和大车前苷的相对含量先下降后上升，桃叶珊瑚苷和金雀异黄酮的相对含量先上升后下降。以上所检测到的环烯醚萜和黄酮类物质，具有广泛的抗氧化活性和药理作用。Zhang等[18]研究发现苦杏仁苷可以治疗呼吸系统疾病、改善各种肺病引起的肺损伤。韩彦琪等[19]发现连翘酯苷E、咖啡酸等化学成分通过作用于关键蛋白，干预了多个与清热解毒相关的生物过程，从而对COVID-19具有一定的治疗作用。崔佳莹等[20]总结，金雀异黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管、防治骨质疏松等药理作用，并能协同化疗药物提高化疗的效果。Sun等[21]发现5-O-甲基维斯阿米醇苷通过降低炎症因子的含量，有效地逆转脂多糖LPS诱导的小鼠抑郁样行为。通过前人的研究，可以发现‘胭脂红’花瓣中的这类代谢物具有很高的药用价值，这表明‘胭脂红’作为桂花的新品种，其所含的化学成分也有进一步挖掘和利用的价值。

桂花是重要的香花树种，且‘胭脂红’有着独特的香气，所以本研究也特别关注了其香气成分的组成。将本研究所测得的34种香气成分的相对含量进行比较分析，结果表明相对含量最高的是紫苏醇，其次是3,4-二羟基苯丙酸酯、香叶酸和茉莉酮酸甲酯等。施婷婷等[22]比较分析‘波叶银桂’、‘雨城丹桂’和‘日香桂’的香气成分，发现这3个品种的香气成分都以芳樟醇及其氧化物、紫罗兰酮等烯萜类物质为主，但未测出紫苏醇、香叶酸和茉莉酮酸甲酯等。然而，张雪松等[23]通过对金桂浸膏的香气成分进行分析，结果包含了本研究所测的‘胭脂红’花瓣的部分成分，比如紫苏醇、香叶酸、棕榈酸、亚麻酸和硬脂酸等。综合以上研究结果，‘胭脂红’有着特殊的香气成分组成，推测可能与品种、栽培条件和试验方法等多种因素有关。这个推论与张静等[24]对不同品种牡丹香气成分分析的结论是一致的。

通过KEGG富集分析，本研究富集到了与花香有关的苯丙氨酸代谢途径和α-亚麻酸代谢途径，以及与花色有关的单萜生物合成途径。苯丙氨酸代谢途径的底物苯丙氨酸，在苯丙氨酸解氨酶的催化下生成反式-肉桂酸，反式-肉桂酸再经过一系列甲基化、酰基化等其他反应生成咖啡酸等各类芳香族化合物[25]。然而咖啡酸等香气成分的积累规律与反式-肉桂酸差异较大，推测与该通路中其他关键基因的表达量有关。单萜生物合成途径的底物牻牛儿基焦磷酸(GPP)是萜类骨架生物合成途径的中间产物，其在四异戊二烯焦磷酸合成酶(GGPS)的催化下生成类胡萝卜素生物合成通路的底物牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(GGPP)[26]。韩远记[27]研究表明，桂花花瓣中色素主要是类胡萝卜素，加之‘胭脂红’花瓣颜色在S2时期开始加深，本研究推测S2时期类胡萝卜素生物合成有关基因表达量较高，导致类单萜生物合成途径在S2时期表达量较低。

以上推测需要后续进行转录组学的分析来验证。下一步研究中，可以将代谢组学和转录组学相结合，进一步分析特殊药物化学成分和香气成分的分子基础，解析特殊花色形成的代谢通路，为更好地挖掘和利用‘胭脂红’的药用价值，以及通过分子手段改良桂花的花色、花香提供理论依据。