苹果树腐烂病菌Zn(Ⅱ)2Cys6类转录因子Vmzctf-07的鉴定及其功能分析

朱立华，刘召阳，刘 维，张贤玉，黄丽丽，冯 浩

(西北农林科技大学 植物保护学院 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨陵 712100)

由子囊菌苹果黑腐皮壳(ValsamaliMiyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病是一种严重影响苹果健康生产的重大枝干病害。该病害主要危害果树枝干皮层部分，造成树皮腐烂坏死，甚至枝枯树死[1]。深入解析病菌致病机理，对病害防控新策略制定和新技术研发具有重要指导意义。

转录因子(transcription factor，TFs)是转录过程中重要的基因表达调控因子。探究苹果树腐烂病菌侵染过程中转录因子的表达及功能，有助于深入解析病菌侵染致病机理。前期研究发现转录因子在V.mali生长发育和侵染致病过程中发挥重要作用。VmSeb1缺失突变体的生长速率和致病力较野生型显著降低[2]。而转录因子VmPacC广泛参与各种生物途径，特别是V.mali酸化其定殖环境和致病力所必须的[3]。重要的是，Zn(Ⅱ)2Cys6类转录因子Vmtf36、Vmtf312、Vmtf1034参与调节V.mali的生长发育，而Vmtf81参与调节病原菌致病力[4]。

锌指蛋白是指蛋白含有锌元素且能够与DNA结合，在转录和翻译过程中发挥重要作用的转录因子，存在于许多真菌生物中，如稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、构巢曲菌(Aspergillusnidulans)、淡紫色拟青霉(Paecilomyceslilacinus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)和甲醇酵母(Pichiapastoris)等[5-9]。Macpherson等根据锌指结合基序将锌结合蛋白分为Cys2His2(C2H2)、Cys4(C4)和Cys6(C6)三大类[10]。Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子的基序为Cys-X2-Cys-X6-Cys-X5-12-Cys-X2-Cys-X6-8-Cys，是真菌所特有的一类转录因子[8]。

本试验前期通过RNA-seq技术对菌丝体和病菌-苹果互作24 h的2组样本进行转录组测序分析，发现属于Zn(Ⅱ)2Cys6家族的Vmzctf-07在侵染过程中稳定上调表达[11]。然而，Vmzctf-07是否参与V.mali的生长发育、非生物胁迫应答及致病功能目前尚不明确。为此，本研究首先通过酵母单杂交和亚细胞定位对Vmzctf-07的转录激活功能和亚细胞定位进行解析，并通过构建其基因缺失和回补突变体探究该基因在病原菌生长、胁迫应答和致病力方面的功能。研究结果能够为深入解析苹果树腐烂病菌Zn(Ⅱ)2Cys6类转录因子的功能奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株和质粒 苹果树腐烂病菌野生型强致病菌株03-8以及相关质粒pCAMBIA1302-GFP、pGBKT7、pFL2、pDL2等均由西北农林科技大学植物保护学院植物病害综合治理实验室提供。

1.1.2 试剂 ChamQTM SYBR®qPCR Master Mix试剂盒，phanta max super-fidelity DNA polymerase，ClonExpress Ⅱ one step cloning kit，购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；QuickCut限制酶购于TAKARA公司；DH5α感受态细胞购于北京擎科生物科技有限公司；GV3101感受态细胞购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 Tissue lyser-96全自动样品快速研磨仪，上海净信科技；Olympus FV1000激光共聚焦显微镜，OLYMPUS公司；电转化仪，美国Bio Rad公司；PCR仪，美国Thermo公司。

1.1.4 引物设计 本试验所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 转录激活域验证 以病健交界处组织的cDNA为模板，利用Vmzctf07-up-F/R、Vmzctf07-between-F/R、Vmzctf07-down-F/R等引物分别进行目的片段的扩增。使用QuickCut限制酶NdeI和SalI双酶切pGBKT7载体，酶切体系及PCR反应程序参见说明书。使用ClonExpress Ⅱ one step cloning kit进行目的片段与线性化载体的连接。将连接产物热激转化至DH5α感受态细胞中，随后涂布于含有卡那霉素的LB平板，37 ℃培养16～20 h后挑取单菌落检测，并将检测正确的单菌落摇菌并提取质粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

参考YeastmakerTMYeast transformation system 2 User Manual方案制备AH 109酵母感受态，并进行热激转化，取150 μL酵母菌液涂于SD/Trp培养基平板，3 d后将阳性克隆菌株避光点板于含有X-α-gel的SD-Trp-His-Ade的平板，以pGBKT7空载为对照，30 ℃避光培养3～4 d。

1.2.2 亚细胞定位观察 以03-8菌株侵染的苹果枝条cDNA为模板，以Vmzctf07-1302-F/R为引物进行目的片段扩增。使用QuickCut限制酶NcoI和SpeI双酶切pCAMBIA1302-GFP载体，参考1.2.1方法构建表达载体。将测序正确的重组质粒电击转化到农杆菌感受态GV3101并获得阳性克隆农杆菌菌液。

利用农杆菌介导的本氏烟瞬时表达系统，以pCAMBIA1302-GFP为对照，在5 mL含有卡那霉素和利福平抗生素的LB液体培养基中加入100 μL pCAMBIA-1302:Vmzctf-07农杆菌菌液，180 r/min，28 ℃过夜培养。菌液摇至OD600为0.6时，6 000 r/min离心5 min，收集菌体，用10 mmol/L的MgCl2溶液洗涤菌体，6 000 r/min离心5 min，重复2次，随后用含有终浓度为10 mmol/L的MES缓冲液悬浮菌体，调节OD600为0.2～0.6，黑暗静置3 h。菌液注射于4～5周龄健康烟草叶片背面，注射48 h后，在激光共聚焦显微镜下观察荧光表达情况。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in this study

图1 转录因子Vmzctf-07分段Fig.1 Sequence segmentation of Vmzctf-07

1.2.3 基因缺失突变体构建 采用Double-joint PCR技术构建基因敲除载体[12]。以质粒pFL2为模板，以EX-G418-F/R为引物扩增报告基因neo；以03-8菌丝DNA为模板，用引物Vmzctf-07-1F/2R与Vmzctf-07-3F/4R扩增该基因的up与down片段。将up与down片段与neo片段进行连接，构建“up-neo-down”基因敲除盒载体并保存在-20 ℃冰箱备用。

参考宋娜等[13]方法制备原生质。参照高静等[14]方法进行PEG介导的原生质体遗传转化。以G418作为筛选抗生素，将Vmzctf-07敲除载体转化至03-8的原生质体中。

1.2.4 缺失突变体检测 以提取转化子DNA为模板，以Vmzctf-07-5F/6R为引物进行初筛检测，将获得的候选阳性转化子，再分别以Vmzctf-07-5F/6R(检测目的基因)、G418-F/R(检测标记基因neo)、Vmzctf-07-7F/G418-R(检测上游重组)和G418-F/Vmzctf-07-8R(检测下游重组)为4对引物进行PCR检测，若检测候选转化子目的基因片段无条带，但抗性片段和两翼重组片段处出现正确条带，则表明Vmzctf-07基因被成功敲除。

1.2.5 突变体回补 以野生型03-8菌丝基因组DNA为模板，以HB-Vmzctf-07-F/R为引物扩增目的基因和目的基因前1.5 kb的回补片段，使用XhoI酶切pDL2载体，并将回补片段链接在pDL2质粒上，构建回补载体。以Vmzctf-07突变体菌株制备原生质，以潮霉素B为筛选抗生素，将回补载体转化进Vmzctf-07突变体的原生质。

1.2.6 生长速率测定 从活化的野生型03-8、敲除突变体及回补突变体菌落边缘打取菌饼(Φ=5 mm)，分别接种于PDA固体培养基中，置于25 ℃恒温培养箱中，2 d后观察并测量菌落直径，使用SPSS 20.0软件分析数据。试验设置3次生物学重复。

1.2.7 非生物胁迫(NaCl与H2O2)测定 参考马晨琛[4]的方法，配置含0.1 mol/L NaCl的PDA固体培养基，用于测定Vmzctf-07的渗透胁迫。测定Vmzctf-07的氧化胁迫时，因H2O2易热解，需先配置含10 g/L 的PDA培养基，待培养基温度降至40～50 ℃后再加入H2O2，使H2O2终浓度为12 mmol/L。以PDA为对照，按1.2.1方法活化菌株，将各突变体、回补突变体和野生型菌株分别接种在相对应的培养基上，按1.2.7方法测定生长速率，试验设置3次生物学重复。用SPSS 20.0分析数据，按下列公式计算抑制率：

抑制率={1-[(对照菌落直径-5)-(处理菌落直径-5)]/(对照菌落直径-5)}×100%

1.2.8 敲除突变体致病力测定 参考臧睿等接种方法[15]，将野生型03-8、敲除突变体及回补突变体菌饼(Φ=5 mm)接种于枝条伤口处，黑暗条件下，25 ℃保湿培养，4 d后用手术刀轻轻刮除病部表皮层，记录枝条病斑长度。试验设置3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 Vmzctf-07转录激活域验证

利用Vmzctf-07全长、up、between和down片段分别构建pGBKT7重组载体，进而利用酵母单杂交技术检测转录因子Vmzctf-07的激活功能。结果如图2所示，携带Vmzctf-07的down片段和全长total的AH109酵母转化菌株均能在加有X-α-gel的SD-Trp-His-Ade缺陷培养基上生长并变蓝，说明Vmzctf-07具有转录激活功能，其转录激活域可能存在于down区段。

图2 Vmzctf-07转录激活域验证Fig.2 Transcription activation domain verification of Vmzctf-07

2.2 Vmzctf-07亚细胞定位

在488 mm激发光波下观察绿色荧光，结果如图3所示，在本氏烟草叶片瞬时表达48 h后，发现对照组pCAMBIA-1302:GFP荧光定位在细胞核和细胞膜上，重组载体菌株pCAMBIA-1302:Vmzctf-07荧光定位于细胞核。

图3 Vmzctf-07定位于植物细胞核Fig.3 Vmzctf-07 is localized in plant cell nucleus

2.3 Vmzctf-07敲除突变体构建

利用PEG介导的原生质体转化技术构建Vmzctf-07的缺失突变体。经G418抗生素进行2次筛选，共获得1 339个转化子。如图4所示，经过5F/6R初步筛选后，利用4对引物共同检测，最终获得4个Vmzctf-07敲除突变体，分别命名为Vmzctf-07-87、Vmzctf-07-88、Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91。

注:1为5F/6R引物检测；2为G418-F/R引物检测；3为7F/G418-R引物检测；4为G418-F/8R引物检测。图4 Vmzctf-07敲除突变体PCR检测Fig.4 PCR detection of Vmzctf-07 knockout mutant

2.4 Vmzctf-07回补突变体构建

选取Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91 2个敲除突变体进行回补试验，用潮霉素B和G418抗生素共同进行筛选。检测结果如图5所示，以目的基因的5F/6R为引物进行PCR验证，获得2个正确的回补菌株，分别为HB-Vmzctf-07-89和HB-Vmzctf-07-91。

图5 回补突变体PCR检测Fig.5 PCR detection of gene-replenishing mutants

2.5 Vmzctf-07生长速率测定

分别将野生型03-8菌株、Vmzctf-07缺失突变体和回补突变体菌株接种于PDA平板上并测量各自菌落直径。结果如图6所示，与野生型03-8菌株相比，Vmzctf-07敲除突变体的生长速率下降33.79%，缺失突变体菌株的生长速率与野生型差异显著(P=0.05)，而回补突变体与野生型03-8菌株的生长速率差异不显著。

图6 Vmzctf-07突变体生长速率测定Fig.6 Growth rate determination of Vmzctf-07 mutants

2.6 非生物胁迫(NaCl与H2O2)测定

野生型菌株03-8在0.1 mol/L的NaCl胁迫下，生长速率平均下降48.91%，Vmzctf-07基因缺失突变菌株在0.1 mol/L的NaCl胁迫下生长抑制率高达65.86%，相比于野生型，抑制率提高了16.95%，Vmzctf-07基因缺失突变体的抑制率与野生型差异显著(P=0.05)，基因回补菌株抑制率与野生型差异不显著(P=0.05)。

野生型菌株03-8在12 mmol/L的H2O2胁迫下，生长速率平均下降7.06%，Vmzctf-07缺失突变菌株的生长速率下降25.92%，基因缺失突变体的抑制率与野生型相比差异显著(P=0.05)，回补菌株与野生型差异不显著(P=0.05)。

2.7 致病力测定

通过接种离体枝条法测定Vmzctf-07的敲除突变体、回补突变体和野生型菌株的致病力，结果如图9所示，Vmzctf-07的4个敲除突变体菌株的致病力与野生型菌株的致病力差异显著(P<0.05)，敲除突变体致病力平均下降了36.99%，而回补突变体菌株均恢复了致病力，与野生型菌株的致病力差异不显著。

图7 Vmzctf-07突变体非生物胁迫响应测定Fig.7 Abiotic stress response of Vmzctf-07 mutants

图8 非生物胁迫对Vmzctf-07缺失突变体生长速率分析Fig.8 Analysis of abiotic stress on the growth rate of Vmzctf-07 deletion mutants

图9 Vmzctf-07突变体致病力测定Fig.9 Pathogenicity test of Vmzctf-07 mutants

3 结论与讨论

Vmzctf-07具有转录激活功能，发挥转录激活功能的区域可能位于down区段(aa 1 455～aa 1 644)；Vmzctf-07定位于细胞核具备转录因子定位特征；成功构建4个Vmzctf-07缺失突变体(Vmzctf-07-87、Vmzctf-07-88、Vmzctf-07-89、Vmzctf-07-91)和2个回补菌株(HB-Vmzctf-07-89和HB-Vmzctf-07-91)。分析表明，Vmzctf-07参与调控V.mali的菌丝生长、非生物胁迫响应和致病过程。

苹果黑腐皮壳菌是一种弱寄生真菌，在侵染寄主时通过释放细胞壁降解酶、毒素、效应蛋白和milRNA等物质协助入侵[16-21]。此外，转录因子也可参与调控病原真菌细胞内多种信号转导过程。研究发现，真核生物转录因子的蛋白结构组成一般包含转录激活或抑制域(activating domain，AD)和DNA结合域(DNA binding domain，BD)2个相对独立的片段及1个核定位信号(nuclear localization signal，NLS)[22-23]。AD域一般位于蛋白的C端酸性氨基酸区、谷氨酸富集区、N端的丝氨酸-苏氨酸富集区和脯氨酸富集区[24]。转录因子能与真核生物启动子区特定的DNA序列结合，调控靶基因的转录，本研究表明Vmzctf-07基因能够激活下游报告基因的表达，具有转录激活活性，且转录激活域可能位于蛋白肽链的C端(down区域)，这也为研究该基因的功能和筛选与其互作的蛋白提供了一定基础。

研究发现，Zn(Ⅱ)2Cys6类转录因子参与真菌的生长发育、对外界的胁迫应答、致病性等过程。Habig等[25]发现小麦叶枯病菌(Zymoseptoriatritici)中的转录因子Zt107320影响Z.tritici的生长。细叶百合(Liliumpumilum)中转录因子LpWRKY20参与调节百合鳞茎休眠解除进程[26]。本研究通过测定Vmzctf-07的缺失突变体和回补突变体菌株的生长速率，结果发现Vmzctf-07敲除突变菌株生长速率显著下降，表明其参与调控V.mali的生长发育，与前人研究结果一致。苹果树腐烂病菌转录因子Vmtf28、Vmtf81、Vmtf315、Vmtf544、Vmtf898、Vmtf1034和Vmtf1049参与V.mali盐离子胁迫应答[4]。姚权等[27]将果生刺盘孢菌(Colletotrichumfructicola)中CfHac1基因敲除后，发现敲除突变体ΔCfhac1对山梨糖醇和KCl渗透压胁迫敏感性增加。稻瘟病菌(M.oryzae)中转录因子的Moapl，具有YAP1转录因子的保守结构域，其敲除突变体会降低对H2O2的耐受性[28]。李雪等[29]发现小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici) Zn(Ⅱ)2Cys6类转录因子PSTG-00514正调控条锈菌耐高温胁迫。转录因子还参与调节植物的干旱胁迫，干旱可诱导拟南芥rd29A基因的表达[30-31]。本研究发现，在0.1 mol/L的NaCl和12 mmol/L的H2O2胁迫下，Vmzctf-07基因缺失突变体与回补突变体相比，生长速率均显著下降。综上，说明真菌转录因子对多种非生物胁迫有一定的影响。Lu等[32]敲除稻瘟病菌(M.oryzae)中Zn(Ⅱ)2Cys6类转录因子CNF1和CNF2后，突变体菌株降低了水稻的致病力。此外，Chambers等[33]研究发现油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculan)Zn(Ⅱ)2Cys6类转录因子ptf1通过体外传代过程中发生的碱基对取代从而导致病原菌的致病性减弱。Vmzctf-07缺失突变体对苹果枝条的侵染致病减弱，说明其同样会参与V.mali的致病过程。