海洋环境化学综合实验课程改革与实践*

皮永蕊，唐永政，段晨阳，孙淑娟

(烟台大学海洋学院，山东 烟台 264005)

海洋环境化学是高等理工科院校本科海洋科学专业一门重要的专业基础课程。主要任务是研究海洋环境包括海洋大气中污染物质迁移、转化、降解的原理和规律，其大多需要依靠实验研究解决，即通过实验分析污染物质所发生的物理、化学及生物过程[1-2]。海洋环境化学设置一个学分的实验课程，但是实验大多以验证型实验为主。在高等教育制度不断改革的推动下，全国高校对理工科学生的要求已从单纯的书本知识掌握和动手能力考察逐渐转变为对理论知识的深入理解、探索以及综合分析素质的培养[3-5]。因此，在海洋环境化学实验教学中设置综合性实验，有利于提高学生寻找问题、思考问题、分析问题并有效解决问题的能力，激发独立思考和创新的意识。

刚果红是现代印染技术中常用的一种联苯胺类直接偶氮类染料，其不需要任何媒介剂就可以对纺织物直接上色[6]，化学名为：二苯基-4，4’-二(偶氮-2-)-1-氨基萘-4-磺酸钠，外观为棕色或红色粉末。可溶于水和醇，溶于水后呈黄红色，可用作酸碱指示剂，变色范围为3.5～5.2，溶于醇，呈橙色。过去曾广泛应用于棉与粘胶的染色，如今在造纸工业中用量颇大，由于其易溶于水和醇的特性，因此在生产和使用过程中流失率高，容易进入水体和环境中。如何有效降解这类具有污染性的染料分子[7]，如何降低化学染液对环境和人类的危害成为了亟待解决的问题。目前较为成熟的方法主要有活性污泥法、生物膜法和物理(吸附，离子交换，超滤法)、化学法(混凝，氧化还原，电化学法)等[8]。

活性炭改性即通过对活性炭采用人工物理，化学或生物手段处理后，改变活性炭表面的官能团，得到性质改变的吸附剂应用于生产活动。活性炭改性方法有许多种，常见的有酸改性、碱改性、等离子体改性、负载改性、微生物改性和物理改性等[9]。传统改性方式如酸碱改性由于效率低、只增加对单一种类污染物的吸附性能，因此发展受到了阻碍[10]。而等离子体改性也拥有多种弊端，如成本高、应用于生产可行性低。在活性炭改性手段中最有前景和应用价值的就是微生物改性[11]。微生物作为一种容易培养的染料吸附载体，愈来愈受到人们的关注，生物吸附剂具有生产成本低，无二次污染；来源广泛，操作条件温和；可重复使用，吸附性能好等优点[12]。此外，生物吸附法与生物降解法相比，主要优点是在吸附过程中无需外界的碳源和氮源供给[13](大多数情况下)，且不会受到水中有毒化学物质的影响，因此成本低且可以多次循环使用。由于活性炭表面疏松多孔的特点，为微生物的附着和繁殖提供了一个良好的微环境域[14]，将微生物和活性炭混合并在一定条件下处理后，微生物附着在活性炭表面，提高了活性炭分子的比表面积，增强了活性炭分子的吸附性能[15]。

开设烃降解菌改性活性炭吸附刚果红的综合实验，能够使学生更好的理解海洋环境化学中关于污染物在环境中的物理迁移过程中的吸附解析过程，同时将理论课中涉及的相关吸附模型进行运用。另外，材料表征所用到的大型实验仪器如电子扫描电镜、透射电镜等引入到实验中，使学生在掌握材料制备的基础上，进行研究性学习和探索。同时，通过本次综合实验的开设，进一步强化学生的文献检索与阅读能力，科学实验动手能力、科研数据处理能力以及科学撰写论文的能力。本实验可以作为海洋科学专业、环境相关专业以及化学类相关专业的本科生开放性综合实验，进一步培养学生的科研实践能力。

1 实验目的

(1)掌握烃降解菌改性活性炭的方法；

(2)掌握烃降解菌改性活性炭对刚果红溶液的静态吸附、动态吸附以及解析过程，以及实验数据的处理方法，熟悉Origin作图；

(3)掌握分光光度法测定水溶液中刚果红浓度的方法；

(4)了解扫描电子显微镜(SEM)以及透射电子显微镜(TEM)等仪器的原理，掌握测试样品的制备方法，并可根据所得数据对样品进行简单的结构解析；

(5)掌握微生物系统发育树构建的方法，学会利用Mega软件构建微生物系统发育树。

2 实验原理

活性炭吸附法是目前研究的较为透彻且被广泛应用的一种固体吸附剂。微生物作为一种容易培养的染料吸附载体，具有生产成本低，无二次污染；来源广泛，操作条件温和；可重复使用，吸附性能好等优点。由于活性炭表面疏松多孔的特点，为微生物的附着和繁殖提供了一个良好的微环境域，将微生物和活性炭混合并在一定条件下处理后，微生物附着在活性炭表面，提高了活性炭分子的比表面积，增强了活性炭分子的吸附性能。

3 实验教学设计与过程

3.1 实验教学设计

该综合实验采用线上线下相结合的模式，如图1所示。

图1 综合实验教学方案整体实施框架

具体步骤为：教师通过雨课堂平台发布综合实验教案，介绍实验课题的研究背景及意义、实验原理及目的、实验任务，根据烃降解菌改性活性炭的制备、表征以及吸附刚果红的行为研究，提出具体的任务。在具体实验之前，学生不受时间空间的限制，只需在智能手机或者电脑上下载任务，并根据实验的关键词查阅中外文文献，了解与实验相关的研究背景与现状。根据分组情况，明确组内分工，根据讨论结果，形成实验方案的初步设计，完成预习任务。同时将实验方案通过雨课堂上传至班级讨论组，与指导教师及其他组同学进行探讨，制定最终可行的实验方案。在学生实施实验过程中，指导教师负责实验设备使用的培训及相关问题的解答。实验结束后，学生在教师的指导下撰写科研论文并进行PPT展示。

3.2 实验过程

烃降解菌改性活性炭吸附刚果的综合实验包括烃降解菌的筛选、分离及鉴定，烃降解菌改性活性炭的合成、表征及吸附刚果红行为研究，其实验技术路线如图2所示。各小组根据技术线路框图，结合事先设计好的实验方案，进行实验。

图2 烃降解菌改性活性炭吸附刚果红的实验技术路线框图

3.2.1 烃降解菌的筛选与鉴定

以原油为唯一碳源，从烟台港被石油烃污染的表层海水与表层沉积物中，筛选出能够降解石油烃化合物的细菌，分离纯化后，得到单一菌株。根据DNA试剂盒上的操作流程提取细菌DNA，然后进行16S rRNA测序。序列拼接成功后，上传至NCBI网站进行Blast比对，得到相似性高的序列。使用MEGA X软件构建细菌的系统发育树。

对筛选得到的单一菌种进行富集培养，取生长对数期的细菌进行TEM观察。具体步骤如下，利用高速冷冻离心机对所得生长对数期的细菌进行离心，然后用无菌水洗涤3～5次。

3.2.2 烃降解菌改性活性炭的制备与表征

称量6 g活性炭，研磨至100目以下后放置于小烧杯中，加入浓硝酸浸泡1天，静置12 h后弃掉上清液，然用无菌水清洗3～5次，弃去上清液，将剩余部分放置于恒温鼓风干燥箱中，在100 ℃下烘干12 h。向烘干好的活性炭中加入60 mL环氧氯丙烷和30 mL N,N-二甲基酰胺，在室温条件下磁力搅拌60 min，静置12 h后弃掉上清液，将剩余部分放置于恒温鼓风干燥箱中，在40 ℃下烘干12 h至完全干燥。

将活性炭采用以上步骤处理完毕后，分析天平称量并记录其质量，加入等质量的OD600=1的YD-D细菌悬浮液，涡旋混匀后，进行冷冻干燥。取样后采用SEM获得改性前后活性炭的表面图像。

3.2.3 烃降解菌改性活性炭吸附刚果红性能测定

配制1000 mg/L的刚果红母液。然后分别稀释至不同的浓度，转移到试剂瓶中留以备用。

将上述1000 mg/L刚果红母液进行梯度稀释，在波长497 nm的条件下，测定不同浓度刚果红溶液的吸光值，绘制刚果红浓度-吸光度曲线。

取40 mL不同浓度的刚果红溶液至50 mL的带帽透明玻璃样品瓶中，加入吸附剂，在恒温振荡器中吸附1 h后，测定吸附后刚果红的浓度。考察刚果红初始浓度、吸附剂用量、刚果红溶液初始pH对吸附效果的影响。

在上述优化实验的基础上，进行动力学吸附实验。配制1.5 L确定的浓度的刚果红溶液，置于2 L的大烧杯中，按照上述实验结果中刚果红溶液与吸附剂的体积质量之比加入相应的吸附剂，将其置于磁力搅拌器中，转速设定为120 rpm。分别在1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180, 240 min，取上清液测定刚果红溶液的吸光度。实验设置三个平行。

3.3 数据处理

根据刚果红浓度与吸光度的标准曲线，可以计算得到吸附前、后刚果红溶液的C0和Ce，并采用以下公式计算吸附量qe和脱色率[16]。

(1)

式中：qe——吸附平衡时吸附剂的吸附量,mg/g

Ce——吸附平衡时的刚果红的浓度,mg/L

C0——吸附前刚果红的初始浓度,mg/L

m——吸附剂的质量,g

V——刚果红的体积,mL

(2)

式中：η——吸附剂的脱色率,%

Ce——吸附平衡时的刚果红的浓度,mg/L

C0——吸附前刚果红的初始浓度,mg/L

采用拟一级动力学和拟二级动力学方程对实验所得的动力学数据进行拟合[17]。

拟一级动力学模型为：

ln(qe-qt)=lnqe-k1t

(3)

拟二级动力学模型为：

(4)

式中：k1k2(g/(mgmin))分为拟一级动力学常数，min,k2为，mg/gj拟二级动力学常数,g/(mgmin)，t为吸附时间min;qt为t时刻的吸附量,mg/g;qe为平衡时的吸附量,mg/g。

4 结果与讨论

4.1 烃降解菌的筛选与鉴定

在这一环节，指导教师监督学生操作的规范性及安全性，特别是微生物培养过程中的无菌操作。指导学生完成DNA提取及PCR扩增。掌握通过NCBI网站进行细菌序列Blast比对的方法，并会下载相似序列。初步掌握利用软件MEGA X构建细菌的系统发育树。采用普通电子显微镜及TEM观察所筛选的菌株，要求学生初步了解相关仪器的原理及操作方法。掌握细菌固定及TEM前处理过程，对所得普通电子显微镜及TEM照片进行初步分析。

学生通过以原油为唯一碳源，筛选、分离得到单菌YD-D。经革兰氏染色后发现YD-D为革兰氏阳性菌，在100倍光学显微镜下的照片如图3a所示。从图3a中可以看出，YD-D为二聚体，且有团聚的现象。在透射电子显微镜下的照片如图3b所示，可以看到YD-D为短棒状，没有纤毛和鞭毛。经16S rDNA测序，YD-D细菌中共检测到1458 个碱基。将基因序列上传到NCBI数据库进行BLAST比对，发现与YD-D序列相似度最高的是苏云金芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌及解蛋白芽胞杆菌(99%)等十几株菌。从NCBI网站上下载与YD-D相似性较高的序列，利用软件MEGA X通过最大似然法建立了系统发育树，结果如图3c所示，通过上述分析可得YD-D菌属于芽孢杆菌属。

图3 烃降解菌YD-D的电子显微镜照片(100×)(a)，TEM照片(b)，最大似然法构建的系统发育树(c)

4.2 烃降解菌改性活性炭的制备与表征

根据各小组指定的实验方案，指导教师监督学生进行相关实验试剂用量的计算，以及实验仪器的选择，提醒学生不同小组实验条件的差异，注意操作的规范性及实验的安全性。要求学生了解冷冻干燥机的原理及操作步骤，提醒学生对样品进行预冻处理。采用SEM观察所筛选的菌株，要求学生初步了解SEM的原理及操作方法。掌握样品SEM前处理过程，对所得SEM照片进行初步分析。

图4展示了活性炭以及烃降解菌改性活性炭的SEM图像。如图4a和图4b所示，活性炭的颗粒相对较大，6000倍放大后，颗粒的表面凹凸不平，具有较高的比表面积，能够吸附水溶液中的污染物质。与图4c和图4d相比，降解菌改性活性炭呈蜂窝状结构，表面经细菌扩张，具有较大的比表面积，对染料或污染物有较好的亲和力。说明改性后的表面结构发生了改变，为吸附刚果红提供了更多的活性位点。

图4 活性炭以及烃降解菌改性活性炭的SEM照片

4.3 烃降解菌改性活性炭吸附刚果红行为研究

把烃降解菌改性活性炭应用于刚果红溶液的吸附实验中，主要涉及不同影响因子，如刚果红溶液的初始浓度、pH以及吸附剂用量，吸附动力学等的考察，分析其实用价值。在这一环节，各实验小组考察的因子不同，相应的实验条件也不同。学生根据各组的实验结果，利用Excel、Origin、SPSS等软件进行数据处理。针对实验中出现的问题进行讨论，同时把问题及讨论结果反馈给教师，提交研究报告，指导教师根据学生的问题反馈及研究报告进行批阅并提出修改建议。最后各小组根据自己的实验结果及指导教师的批阅与建议，撰写研究论文，并进行PPT展示。

4.3.1 不同影响因子对烃降解菌改性活性炭吸附刚果红溶液的影响

图5为不同影响因子对刚果红溶液吸附及脱色率的影响。随着刚果红初始浓度的升高，烃降解菌改性活性炭对刚果红的平衡吸附量也随之升高，脱色率呈现出相反的规律，逐渐降低。当刚果红的浓度为50 mg/L时，吸附量可以达到411 mg/g。随着烃降解菌改性活性炭质量的增加，刚果红的平衡吸附量呈现现增加后降低的趋势，当吸附剂的用量为5 mg时，吸附量达到最大值，约为400 mg/g。随着刚果红溶液初始pH的增加，吸附量先增加后降低，在中性偏弱酸性的范围内(pH=5～7)表现出较好的吸附效果。在pH等于7时，烃降解菌改性活性炭的qe最高，达到389.3 mg/g。相应的，刚果红的去除率也呈现出与平衡吸附量一致的趋势，在pH=7时，脱色率达到最大值。

图5 不同影响因子对对刚果红吸附及脱色率的影响

4.3.2 烃降解菌改性活性炭吸附刚果红的动力学

随着吸附时间的延长，三种吸附剂对刚果红的qe和脱色率最终都趋于一个稳定的数值，说明吸附剂对刚果红的吸附达到了饱和状态。利用拟一级与拟二级方程对所得动力学数据进行拟合，所得结果如图6所示。烃降解菌改性后的活性炭对刚果红的吸附比较符合拟一级动力学方程，而活性炭对刚果红的吸附更符合拟二级动力学方程。

图6 拟一级(a)与拟二级动力学(b)模型拟合结果

5 成绩评定及教学效果评价

成绩评定=实验过程表现(50%)+科研论文(30%)+PPT汇报展示(20%)。针对这一评价方式，在2017级和2018级海洋科学专业同学中展开评价方式的问卷调查，结果显示90%的学生认为这一评价是比较合理的，具有一定的公正客观性。有部分学生提出建议，可以加入小组互评和组内成员互评的结果，采用师生共评价的方法。

实验完成后，通过微信小程序进行问卷调查，结果表明：97%的同学对该实验比较感兴趣(如表1所示)。(1)绝大多数同学认为通过实验前的预习过程，提高了自己的查阅文献的能力，能够积极参与小组讨论，增强了团队合作意识；(2)在实验过程中，几乎所有同学都能参与到实验中来，88%同学认为自己的独立实验能力得到了大幅度的提升，特别是一些基本操作，如微生物的培养、分光光度计的使用等。另外，也提升了大家分析问题和解决问题的能力；(3)在实验结束后，75%的同学认为撰写科研论文和结果展示的过程，提高了写作和PPT制作水平，加深了对理论知识的理解，有小部分同学(19%)觉得撰写科研论文比较难，完成这部分任务比较吃力。

表1 综合实验设计调查结果

通过2017级和2018级同学的实践，该实验设计得到了绝大多数学生的认可，激发了同学们参与综合性科研实验的实验的热情。部分同学表示，想继续深入探究实验的机理，尝试参与发表科研论文。还有同学提出很好的建议，如：(1)发布预习任务时，增加相关视频或者虚拟仿真实验，如实验操作、软件使用，大型仪器的操作；(2)实验过程中，通过拍照、录小视频等方式记录实验过程，增加实验的趣味性；(3)实验结束后，增设“综合实验之我见”“综合实验收获”等小文征稿，并设立投票环节，筛选同学们喜爱的小文发布到雨课堂班级群、班级论坛及微信公众号等，并以此作为成绩考核加分项；(4)结合理论课中涉及的海洋环境污染问题，设计相关污染修复方案。

6 结 语

烃降解菌改性活性炭的合成方法简单、安全，通过SEM和TEM等表征手段，使学生对大型设备的使用有一定的感官认识，而不只是局限于课本或者网络资源。烃降解菌改性活性炭吸附刚果红的测定使学生对科研实验有了基本的认识，通过Origin软件进行数据处理，并撰写科研论文，整个过程可以提高学生的综合实践能与专业素养。通过小组讨论，探索该材料在环境污染治理中的应用，增加学生对环境污染的关注，用自己的一言一行去践行“绿水青山就是金山银山”，进一步增强学生的环境保护和守护海洋的意识，增强了学生的团队合作、PPT制作及演示的能力。