经皮冠状动脉介入术围手术期心肌损伤患者外周血单个核细胞的转录组学分析

陈 傲 陈章炜 夏 妍 周 游 卢淡泊 马嘉琪 钱菊英

PCI目前已成为冠心病血运重建的重要方法，能有效改善患者的生活质量，但为有创操作，由此引发的并发症不容忽视。围手术期心肌损伤(PMI)是PCI常见的并发症之一[1]。最近的研究[2]结果表明，择期PCI术后约有22%的患者发生PMI，且PMI与术后不良事件发生有关。因此，强化PCI术中的心肌保护，减少PMI发生，对冠心病患者的预后具有重要影响。PMI的病理生理过程目前尚不明确，有研究[3]结果表明，炎症反应在PMI发生中起重要作用，但具体机制仍需进一步探索。人外周血单个核细胞(PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，作为免疫系统的主要组成部分，研究其基因表达变化对探索PMI中的免疫应答过程具有重要作用。本研究通过对PCI围手术期PMI患者的PBMC进行转录组学分析，旨在探索其潜在的病理生理机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2018年12月于复旦大学附属中山医院心内科行择期PCI的患者中，随机选取3例术后发生PMI的患者，并按照性别、年龄、疾病史、个人史信息匹配3例术后无PMI患者。排除标准：不稳定性心绞痛、急性心肌梗死、心脏结构异常、急性感染、肝肾功能不全、肿瘤、其他系统性疾病、术中有明显边支闭塞。PMI的诊断按照第四版心肌梗死全球统一定义中关于PMI的标准[4]：术前心肌肌钙蛋白T(cTnT)正常，PCI后24 h内cTnT>0.03 μg/L(99%正常值上限)。本研究经医院伦理委员会审核、批准(批准号为B2016-018)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 临床检测和PBMC分离 收集患者的基本信息，包括性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、吸烟史。分别于PCI术前和术后24 h内采集患者空腹外周静脉血，测定cTnT水平。分离PBMC：于术后收集2～3 mL静脉血置于无菌抗凝采血管中，252×g4 ℃离心10 min，留取下层血细胞以2倍体积的0.9%氯化钠溶液稀释，将稀释后的血细胞悬液缓慢加入含有3 mL Ficoll分离液(北京索莱宝科技有限公司)的离心管中，500×g离心20 min，吸取中间白膜层(即PBMC层)，加入10 mL 0.9%氯化钠溶液112×g离心10 min，洗涤2次，收集细胞后加入1 mL细胞冻存液重悬细胞，最后置于液氮中保存。

1.3 基因文库的构建与测序 由上海欧易生物医学科技有限公司提供技术服务。使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取PBMC总RNA，对经质量检测后的总RNA进行片段化并反转录成cDNA，最后进行PCR扩增。构建好的文库经Agilent 2100 Bioanalyzer生物芯片分析系统(美国Agilent公司)检测合格后，应用Illumina测序仪(美国Illumina公司)进行测序。

1.4 转录组测序(RNA-seq)数据处理和生物信息学分析 利用hisat2将质控后的校正数据与指定的参考基因组进行序列比对，应用htseq-count软件获取每个样本中比对到蛋白质编码基因上的读长数据，最后计算得到基因表达量。应用R语言中的limma包进行差异表达分析，采用错误发现率方法校正P值获得q值，将q<0.05且差异倍数(FC)>2定义为差异表达基因(DEG)，通过DAVID数据库对DEG进行基因本体论(GO)注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析，采用超几何分布法计算P值，获得有差异(P<0.05)的GO注释和KEGG通路，再应用R语言ggplot2包进行可视化。进一步将炎症相关基因导入STRING数据库，将网络边(network edges)设置为置信度(confidence)模式，设定互作来源的证据(active interaction sources)：文本挖掘(textminings)、实验(experiments)、数据库(databases)、共表达(co-expression)、邻接(neighborhood)、基因融合(gene fusion)和同现(co-occurrence)，设定最小互相作用评分(minimum required interaction score)为中置信度(>0.4)，获得蛋白质相互作用网络，并进一步应用Cytoscape 3.7.1软件进行可视化。

2 结 果

2.1 PBMC的转录组学分析 样本质控报告显示，6例样本检测均合格，患者基本信息见表1。与无PMI患者相比，PMI患者PBMC中共筛选出1 769个DEG，其中上调DEG 813个，下调DEG 956个。见图1。

图1 PMI与无PMI患者PBMC中DEG火山图

表1 6例患者的基本信息

2.2 DEG的生物信息学分析 GO富集分析包括生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)3个部分。将DEG导入DAVID数据库进行分析，GO富集分析结果显示：DEG涉及的生物学过程主要包括免疫反应、炎症反应、固有免疫反应，涉及的细胞组分在生物膜、细胞质、核糖体及细胞外基质均有分布，分子功能主要富集在蛋白质结合、RNA结合、受体活性及转录因子活性等方面。见图2A。KEGG整合了基因组、化学分子和生化系统等方面的数据，有助于把基因及表达信息作为一个整体的网络进行研究。将DEG导入DAVID数据库进行KEGG通路分析，结果显示：PMI患者PBMC中表达变化的基因主要涉及的通路包括Toll样受体(TLR)信号通路、TNF信号通路、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLR)信号通路、NF-κB信号通路、补体和凝血级联反应，以及趋化因子信号通路等，且这些信号通路变化的差异有统计学意义。见图2B。

A GO富集分析 B KEGG通路分析图2 DEG的GO富集分析和KEGG通路分析

2.3 蛋白质相互作用网络构建 为进一步分析炎症反应与PMI发生的相关性，将GO和KEGG通路分析富集出的炎症相关基因导入STRING数据库，得到炎症相关的71个DEG的蛋白质相互作用网络图。经Cytoscape 3.7.1软件可视化后，图中节点直径越大表示连接度越高，连接线越粗表示相关性越强。网络图显示，IL1B、TLR、C-X-C基序趋化因子配体(CXCL)、趋化因子受体(CCR)，以及与固有免疫反应和炎症小体相关的基因，如含PYD和CARD结构域蛋白(PYCARD)、NLR、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶4(CASP4)等24个基因均具有较高的连接度，提示这些基因的表达变化与PMI过程中的炎症反应密切相关。见图3。

ALOX15：花生四烯酸-15-脂加氧酶。AOC3：含铜胺氧化酶3。BCL6：B细胞淋巴瘤因子6。C4A：补体成分4A。C5AR1：补体成分5A受体1。C5AR2：补体成分5A受体2。CAMK4：钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ。CCL3：趋化因子3。CEBPB：CCAAT/增强子结合蛋白β。CHI3L1：几丁质酶3样蛋白1。CXCR：C-X-C基序趋化因子受体。F2RL1：F2R样胰蛋白酶受体3。FOS：AP-1 转录因子亚基。FPR1：甲酸基肽受体1。FPR2：甲酸基肽受体2。HCK：SRC-家族蛋白酪氨酸激酶HCK。IL10RB：IL-10受体亚基β。IL1RAP：IL-1受体辅助蛋白。IL23R：IL-23受体。LTBR：淋巴毒素β受体。LY96：淋巴细胞抗原96。LYN：SRC-家族蛋白酪氨酸激酶LYN。MEFV：固有免疫调节因子MEFV。MMP25：基质金属蛋白酶2。MYD88：髓样分化因子88。NAIP：神经元凋亡抑制蛋白。NFAM1：具有ITAM 基序的NFAT激活蛋白。NLRC4：NLR家族含CARD结构域4。NLRP6：NLR家族含pyrin结构域6。OLR1：氧化低密度脂蛋白受体1。ORM1：血清类黏蛋白1。PLA2G2D：IID组磷脂酶A2。PRKCQ：蛋白激酶Cθ。PROK2：前动力角蛋白2。PTAFR：血小板活化因子受体。PTGS2：前列腺素内过氧化物合酶2。PTX3：正五聚蛋白3。S100A12：S100钙结合蛋白A12。S100A8：S100钙结合蛋白A8。S100A9：S100钙结合蛋白A9。S1PR3：鞘氨醇1磷酸受体3。SLC11A1：溶质载体家族11成员1。THEMIS2：选择性胸腺细胞相关蛋白2。TNFAIP：肿瘤坏死因子α诱导蛋白。TNFRSF：肿瘤坏死因子受体超家族成员。TNIP3：肿瘤坏死因子α诱导相互作用蛋白3。ZAP70：T细胞受体相关蛋白激酶ζ链图3 炎症相关的71个DEG的蛋白质相互作用网络图

3 讨 论

作为PCI常见的并发症之一，PMI不仅可削弱血运重建带来的益处，且已成为冠心病患者不良预后的独立危险因素[5]，探索PMI的发病机制和防治措施具有重要的临床意义。目前认为，PCI术中对血管壁的机械损伤、术后内膜下组织暴露、斑块挤压及其碎片造成远端微血管栓塞、微血管痉挛等均可导致PMI发生[6-8]，但其具体机制尚不明确。

本研究从PBMC入手，通过转录组学和生物信息学分析，发现PMI患者PBMC中基因表达情况与无PMI患者间存在较大的差异，这些差异基因可能与PMI的发生、发展密切相关。临床研究结果显示，炎症指标如CRP、粒细胞计数、髓过氧化物酶水平等与PMI发生密切相关，PCI术后的炎症反应水平对临床结局有重要影响[3]。PBMC主要包括淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞，在疾病的炎症反应中发挥重要作用。本研究通过分析PBMC的基因表达，发现PMI患者中表达变化的基因主要聚集在免疫、炎症反应、炎症相关的多条信号通路，如TLR、NF-κB、NLR及趋化因子信号通路，进一步表明炎症反应与PMI的病理生理过程具有一定相关性。

冠状动脉微血管栓塞是导致PMI发生的重要原因之一。既往动物实验证实，炎症反应释放的TNF-α在冠状动脉微血管栓塞导致的心肌损伤中具有决定性作用[9-10]。本研究中的KEGG通路分析发现，TNF信号通路在PMI组与非PMI组患者中具有显著性差异。PCI术中对血管壁的机械应力使冠状动脉内皮层损伤，不仅易导致该部位血栓形成和发生血管痉挛，还可通过激活蛋白激酶C和NF-κB促进细胞黏附分子、趋化因子和细胞因子的表达[11-12]；另一方面，心肌细胞的损伤释放活性氧同样可促进趋化因子表达[13]。趋化因子是细胞因子中一组结构相似、以趋化多种白细胞为主要功能的细胞因子，可进一步募集并激活炎症细胞。本研究结果显示，PMI患者PBMC中有多种趋化因子及其受体相关基因具有较高的连接度，如CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCR1、CXCR2，以及CCR家族成员。这些炎症细胞的募集和激活通过扩大炎症反应进一步损伤心肌，形成损伤-炎症-损伤的恶性循环。此外，除了经典的NF-κB、TLR、趋化因子等炎症信号通路外，IL-1B基因在富集的炎症网络图中占据重要地位。IL-1β的产生和成熟与炎症小体密切相关，损伤的内皮和心肌细胞作为损伤相关的分子模式(DAMP)可通过固有免疫通路激活炎症小体[14-15]。本研究中的网络图显示，PMI患者PBMC中固有免疫反应和炎症小体相关的基因也发生显著变化，如PYCARD、NLRC4、NLRP6、CASP4。

可见，从PBMC角度进行分析研究的结果提示，炎症反应与PMI发生密切相关。2017年的CANTOS(Canakinumab Antiinflammatory Thrombosis Outcome Study)研究[16]证实了IL-1β单克隆抗体卡纳单抗能够在降脂治疗的基础上进一步降低心肌梗死患者不良心血管事件的发生率，开启了冠心病抗炎治疗的大门；接踵而至的Colcot(Colchicine Cardiovascular Outcomes Trial)、LoDoCo2(Low-Dose Colchicine for secondary prevention of cardiovascular disease 2 trial)等研究[17-18]证实了秋水仙碱通过抗炎作用使冠心病患者获益，为临床通过抗炎方式预防、减轻PMI提供了依据；最近的COPE-PCI(Colchicine to Prevent Periprocedural Myocardial Injury in PCI)临床预实验已证实，PCI前6～24 h给予秋水仙碱可减少PMI的发生[19]。因此，期待未来有更多的临床试验进一步验证抗炎治疗在预防PMI中的作用，鉴于本研究使用PBMC的局限性，PMI的病理生理机制在未来需要更为详尽的探索。