HS-SPME-GC-MS/MS 联用分析莲蓉馅料的特征挥发性香气成分

梁梓健，方嘉沁，吴锦源，杜方敏，符树勇，高向阳*

（1.华南农业大学食品学院广东省功能食品活性物重点实验室，广东广州 510642）

（2.广州酒家集团利口福食品有限公司广州市广式焙烤食品加工工程技术研究开发中心，广东广州 511442）

莲蓉是传统广式点心馅料，多用于制作具有莲蓉风味特征的食品，尤其是广式莲蓉馅月饼，备受人们喜爱。莲蓉馅料主要由干莲子、蔗糖和食用油为原料，经浸泡、蒸煮、磨浆、炒制、冷却等多项工序制作而成[1]。在莲蓉馅料的炒制过程中，高温会促使莲蓉馅料发生美拉德反应、油脂逐级降解、风味化合物前体降解等化学反应，从而生成多种挥发性风味化合物，赋予莲蓉馅料独特的风味特征[2]。莲蓉馅料的特征香味来源于其挥发性风味化合物，是评价莲蓉馅料产品品质的重要依据[3]。但目前对于莲蓉馅料的挥发性风味化合物及其呈香特征还未见相关报道。

固相微萃取（SPME）具有操作简便、灵敏度高的优势，常与气相色谱质谱（GC-MS）联合应用于传统食品风味化合物的研究中，王藤等[4]利用SPMEGC-MS 技术探究了不同腌制时间对传统工艺制作的火腿中挥发性风味物质的影响，发现不同腌制时间的火腿挥发性物质呈现出显著性差异。Yao 等[5]采用SPME-GC-MS 技术分析了不同年份四川冬菜的挥发性物质差异。Attchelouwa 等[6]结合SPME-GC-MS 技术和感官评价实验研究了传统高粱啤酒中与感官指标相关的挥发性化合物。

本研究采用了5 种不同加工工艺的莲蓉馅料，利用顶空固相微萃取气相色谱-串联质谱法（HS-SPMEGC-MS/MS）结合相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析莲蓉馅料的挥发性成分及其风味贡献程度；并利用多元化学计量方法对不同种类莲蓉馅料的挥发性化合物进行差异性分析，寻找特征性呈香物质，有助于了解莲蓉馅料在生产过程中香气形成的机制，旨在为莲蓉馅料的风味品质控制与改善提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

5 种莲蓉馅料：广州酒家集团利口福食品有限公司提供，编号分别为C1、C2、C3、C4、C5，其中C1 为纯白莲蓉，C2 为纯红莲蓉，C3 为大师手作纯白莲蓉，C4 为绿色食品级纯白莲蓉，C5 为低糖纯白莲蓉；正己烷：色谱纯，德国Meker 公司。

1.1.2 主要仪器设备

7890B-7000D GC-MS/MS，Agilent 公司；MM400球磨仪，Retsch 公司；MS105DU 电子天平，METTLER TOLEDO 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 顶空固相微萃取

将样品于液氮速冻后研磨，再称取1 g 于顶空瓶中，使用萃取头于70 ℃下对挥发性物质进行萃取收集20 min。

1.2.2 GC-MS/MS 条件

萃取结束后，萃取头插入色谱仪进样口，解析时间为5 min，进样口温度为250 ℃。

气相条件：气相色谱柱为DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气，柱流速为1 mL/min，柱箱升温程序为40 ℃保持5 min，然后以6 ℃/min 的速度上升至280 ℃，并持续5 min。

质谱条件：传输线温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离电压为70 eV，溶剂延迟5 min。

1.2.3 挥发性化合物定量定性

在MassHunter 软件（Agilent）中获得特征峰荷质比、保留时间和峰面积等信息，对单个峰进行过滤，只保留单组空值不多于50%或所有组中空值不多于50%的峰面积数据。基于MWGC 数据库，对检测到的挥发性化合物进行定性分析，以峰面积归一法进行相对定量分析。

1.2.4 数据处理

用R 软件（版本）进行PCA 分析；采用SIMCA-P14.1 进行PLS-DA 建模；利用IBM SPSS 25、Excel软件和Origin 2019b 64Bit进行数据处理及作图。

2 结果与讨论

2.1 5 种莲蓉馅料的挥发性物质分析

基于HS-SPME-GC-MS/MS 的检测结果（5 种莲蓉馅料总离子流图见图1～图5），利用MWGC 数据库对5种莲蓉馅料的挥发性物质进行定性定量分析，结果如表1 所示，共检测到了29 种挥发性物质，包括2 种醇类、7 种醛类、6 种酯类、4 种吡嗪类、3 种烷烃类、2 种呋喃类、2 种酮类、1 种萜类、1 种噻吩类、1 种其他类。总离子流图，并对各类别挥发性成分进行显著性差异分析（p＜0.05），以不同类别的挥发性成分为横坐标，相对百分比含量为纵坐标绘制柱形图，如图6 所示。

表1 5 种莲蓉馅料的挥发性物质相对百分含量Table 1 Relative percentage of volatile components in 5 kinds of lotus seed paste fillings

续表1

结果显示，5 种莲蓉馅料的挥发性成分组成类似，其中醛类（18.38%～36.45%）、酯类（9.97%～23.88%）和吡嗪类（19.07%～29.38%）的化合物含量较多，是主要的挥发性物质。醛类化合物多来源于脂质的自动氧化、β-氧化和氨基酸的降解[7]。由于莲蓉馅料的制备加入了大量的花生油，在加工过程中油脂发生氧化反应降解生成醛类物质。莲蓉馅料中检测到的醛类化合物有己醛、糠醛、(Z)-2-庚烯醛、苯甲醛、正壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛和3-甲基苯甲醛，其中糠醛只有在C2 中检测到。酯类物质是由醇类化合物和游离脂肪酸反应而成，大多酯类化合物的呈味阈值较高，由长链脂肪酸生成的酯类化合物主要呈现为油脂的香味，而短链脂肪酸生成的酯类化合物则呈现花、果香味的气味特征[8]。被检测到的酯类物质有苯甲酸甲酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、环丁烷羧酸3-甲基丁酯和乙酸(二乙氧基)甲酯。吡嗪类和呋喃类化合物都是杂环类化合物，其有着较低的呈味阈值，是食品中常见的风味化合物，主要来源于食品加工过程中糖和氨基酸的美拉德反应，以及硫胺素和氨基酸的自身的降解，多数具有典型的烘烤香味[9,10]。被检测到的吡嗪类化合物有2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5,-三甲基吡嗪和3-乙基2,5-二甲基吡嗪。由此可知，莲蓉馅料的呈香物质主要来源于生产工艺中的脂肪氧化、美拉德反应和风味前体物质降解等化学反应，构成了莲蓉馅料的特征风味。

2.2 挥发性成分主成分分析

PCA 能对多维度的复杂数据进行降维处理，以少数变量的数据表达出原始数据的大部分信息[11]。对5种莲蓉馅料挥发性成分的峰强进行PCA 分析，其二维空间分布图如图7。

PCA 分析中提取了2 个主成分，其方差贡献率分别为44.83%和21.12%，累计方差贡献率达65.95%，说明原始数据的大部分信息能够被这两个主成分解释，可反映出不同莲蓉馅料挥发性成分的组间与组内关系。上述样品的组内距离接近，说明同类样品的不同批次间的挥发性物质组成类似，产品品质稳定性高，试验重复性较好。总体上，5 种莲蓉馅料在PCA 二维图中能明显区分，C1、C2、C4 和C5 在第一主成分中的距离较分散，表明这4 种莲蓉馅料的差异主要体现在PC1 中，C3 与其他样品差异主要体现在PC2 中。C2 和C3 有局部的重叠，说明两种莲蓉馅料的挥发性成分存在一定的相似性。

2.3 5 种莲蓉馅料挥发性成分差异分析

偏最小二乘判别分析（PLS-DA）能够将X 矩阵信息分解成与Y 相关和不相关的两类信息，通过去除不相关的差异来筛选差异变量，找到不同莲蓉馅料的挥发性差异代谢物[12]。利用SIMCA 软件对不同莲蓉馅料挥发性成分建立PLS-DA 模型进行分析。模型中R2 表示模型的拟合程度，Q2 表示模型对新数据的预测能力。一般来说，R2 和Q2 越接近1 说明模型越好。本实验所构建的PLS-DA 模型里，Q2 为0.97，R2X为0.97，R2Y 为0.98，模型稳定且预测能力高。用置换检验法评估模型的有效性，如图3 所示。所建模型的Q2 始终大于随机模型的Q2，且截距＜0，说明模型没有过拟合的情况，可以作为评价不同莲蓉馅料挥发性物质差异的模型。

如图9 所示，PLS-DA 模型中的变量投影重要性值（VIP）可以表示为各挥发性物质对于5 种莲蓉馅料的差异贡献度，物质VIP 值越大，对莲蓉馅料的差异贡献程度越大。选取VIP 值＞1 的挥发性物质作为主要差异物质（图9 中红色部分），分别为糠醛，E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、乙酸(二乙氧基)甲酯、2-氯-2-硝基-丙烷、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷，共10 种挥发性物质。

对上述VIP＞1 的10 种物质进行单因素方差分析，保留具有显著性差异（p＜0.01）的挥发性物质，进一步在不同种莲蓉馅料样品中筛选出8 种重要差异物质，分别为：糠醛、E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷。如图10 所示，利用聚类热图对上述重要差异物质进行可视化分析，得出C1 莲蓉馅料的标志挥发性物质为(±)-3-蒈烯-2,5-二酮，C2 为糠醛，C3 为E,E-2,4-癸二烯醛和苯甲醛、C4 为正壬醛、C5 为十四烷。

2.4 5 种莲蓉馅料主要挥发性化合物香气特征分析

挥发性化合物对风味的影响由物质含量与呈味阈值共同决定，相对气味活度值（ROAV）能相对反映出风味成分在产品中的风味贡献程度，一般认为ROAV＞1 的风味成分为关键风味物质，而ROAV＞0.1的风味成分为辅助修饰风味物质[11]。查阅文献获得莲蓉馅料中各风味化合物的呈味阈值，并计算出ROAV值[11]。定义E,E-2,4-癸二烯醛的相对气味活度值为100，其余风味物质的ROVA 值如表2 所示。

表2 不同莲蓉馅料主要挥发性风味成分的相对风味活度值Table 2 Relative odor activity value of main volatile flavor components in different lotus seed paste fillings

莲蓉馅料中醛类化合物的累积香气值为100.24～100.96，酯类为7.11～54.07、噻吩类为0.22～4.59，其中关键性风味物质有E,E-2,4-癸二烯醛、辛酸乙酯和2-乙酰基噻吩，奠定了莲蓉的主要风味基调。而苯乙醇、己醛、正壬醛、乙酸苯乙酯则起到了辅助修饰莲蓉馅料风味的作用。据报道，E,E-2,4-癸二烯醛具有鸡肉香味和油脂香味，是亚油酸降解的主要产物[26]。其在热反应体系中能降解生成醛类化合物，如莲蓉馅料中的己醛和苯甲醛，这些醛类物质可以继续与莲蓉馅料中美拉德中间产物发生反应，生成愉悦的呈香物质；辛酸乙酯在C1 中的ROAV 值为53.71，明显高于其他4 种莲蓉馅料。其具有类似菠萝、苹果和雪梨等气味的呈味特征，常被报道存在于多种水果和酒类中，是菠萝、啤酒的主要风味物质之一[27]。也有报道称辛酸乙酯能提升玫瑰精油的整体香气[28]；2-乙酰基噻吩是一种具有核桃、硫磺气味特征的含硫化合物，由核糖和半胱氨酸发生美拉德反应产生。有报道它也是肉类食品中风味贡献物质之一[29]。

糠醛只有在C2 中被检测出，是一种由美拉德反应生成的风味物质，具有烤面包、焦香和辛香的气味特征[30]。可能是由于C2 莲蓉馅料在制备过程中添加了焦糖，从而引入了戊糖发生美拉德反应生成糠醛。据报道，莲蓉馅料中的正辛醇、苯乙醇、己醛、糠醛、苯甲醛、正壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-乙基2,5-二甲基吡嗪和2-庚酮在花生油中被检测出，这些化合物共同赋予了莲蓉馅料类似于花生油的香气特征[31,32]。而正辛醇、苯乙醇、己醛、苯甲醛和十四烷则在莲子芯中检测到[33]。

由于5 种莲蓉馅料中的挥发性物质有着不一样的呈味贡献，导致每一种莲蓉都有着独特的香气特征。基于莲蓉馅料的呈香物质（ROVA＞0.01）和重要差异物质，两者的共有部分可被认为是影响莲蓉馅料呈香特性的关键物质（图11），分别是E,E-2,4-癸二烯醛、正壬醛和苯甲醛。可见，影响莲蓉馅料风味的主要风味物质是醛类化合物。

3 结论

研究采用HS-SPME-GC-MS/MS技术比较分析了5种常见莲蓉馅料产品的挥发性成分，发现其挥发性物质的种类相似，主要差异物质是糠醛，E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷。由莲蓉馅料挥发性成分的ROVA值可知，其关键性风味物质有E,E-2,4-癸二烯醛、辛酸乙酯和2-乙酰基噻吩，而苯乙醇、己醛、正壬醛、乙酸苯乙酯则起到了辅助修饰莲蓉馅料呈味的作用。通过绘制主要差异物质与呈味物质的韦恩图，发现E,E-2,4-癸二烯醛、正壬醛和苯甲醛的相对含量差异是影响莲蓉馅料呈香差异的主要原因。本研究从挥发性物质的角度，分析了不同莲蓉馅料香气差异的来源，为莲蓉馅料的风味特征研究和品质评价标准建立提供参考数据。