大球盖菇子实体不同部位挥发性成分的比较分析

陆欢，尚晓冬，王小艳，王春晖，刘建辉，陈晚朱，王瑞娟*，徐宁*

（1.上海市农业科学院食用菌研究所，农业部应用真菌资源与利用重点开放实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201403）

（2.湖南省食用菌研究所，湖南长沙 410013）

（3.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京 210023）

（4.茶陵县兴农食用菌种植农民专业合作社，湖南茶陵 412400）

大球盖菇（Stropharia rugoso-annulata），分类学地位为真菌界，担子菌门，层菌纲，伞菌目，球盖菇科，球盖菇属[1]。大球盖菇是在美国首先发现并报道，主要分布于欧洲、北美洲、亚洲等地，在我国云南、西藏、四川、吉林等地都发现有野生大球盖菇分布，现已在全国大范围内推广栽培。大球盖菇色泽鲜明，肉质嫩滑，菌柄清香脆甜，烘干后有浓郁的香气。大球盖菇中还富含蛋白质、氨基酸、维生素、多种微量元素和膳食纤维，具有低糖、低脂肪等特点[2-4]，具有很高的食药用价值。

产量、品质和颜色等是食用菌生产上的主要农艺性状，近年来挥发性风味成分也成为了重要的农艺性状之一。据报道食用菌中含有的醇类化合物，如1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）是食用菌典型的风味物质，具有浓烈的蘑菇风味[5]；橙花叔醇具有弱的甜清柔美的橙花气息，还带有像玫瑰、铃兰和苹果花的气息；辛醇具有蘑菇香、奶制品香、青香、辛香、薄荷香[6]。酮类化合物有特殊的香气，3-辛烯-2-酮具有强烈的青香和蔬菜香，兼有水果味[7]。微量醛类化合物可使香气更加醇厚，其中苯甲醛和苯乙醛是食用菌主要挥发性成分[8]，辛醛具有似甜橙、油脂、蜂蜜香气[9]。酯类化合物具有各种果实香味。吡嗪类化合物具有芳香的炒食烤香气味[10]，呋喃类化合物具有豆香、果香、青香及类似蔬菜的香韵[11]，2-戊基呋喃具有烘烤香味[12]。顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）已广泛应用于食品中[13]，相较于有机溶剂萃取法和水蒸气蒸馏法，该方法具有更好的准确度、精确度和重复性，且在食用菌挥发性成分方面应用也非常广泛。已在羊肚菌[14]、真姬菇[15]、金针菇[16]、赤芝[17]、香菇[18]、双孢蘑菇[19]、姬松茸[20]、灰树花[21]、桑黄[22]、竹荪[23]和草菇[24]等品种上都有相关报道。

近年来，国内外学者在大球盖菇野生资源驯化、栽培技术、液体菌种、多糖提取、营养成分和酶活等方面开展了大量研究[25-36]，但少见其活性成分的研究报道。大球盖菇柄粗菌盖薄，本研究第一次通过顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用方法分析比较了大球盖菇菌盖和菌柄中的挥发性物质，旨在探明大球盖菇特征香气成分，及为今后大球盖菇品质育种提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 试验材料

大球盖菇新鲜子实体由湖南省食用菌研究所提供。

1.1.2 主要试剂

甲醇、乙腈（色谱纯），美国Fisher 公司。其他试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

GC/MS Solution 色谱工作站和NIST.17 质谱数据库，日本岛津公司；GC/MS-QP2010 型气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；固相微萃取仪、Stableflex 固相微萃取纤维头、顶空萃取瓶，上海安谱实验科技股份有限公司；Scientz 冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；CG001 型厨房干磨机，深圳市德尔有限公司；PL203 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 样品制备

参考徐宁等[37]方法对大球盖菇子实体样品进行预处理。将大球盖菇鲜品置于烘干机中低温烘干，再将菌盖和菌柄分开分别经超微粉碎机粉碎后过100 目筛，放入冷冻干燥机中48 h 后制得干燥样品，置于避光阴凉处密封保存。准确称取菌盖和菌柄各0.1 g 置于10 mL顶空萃取瓶中，使之均匀分布在瓶底并盖上瓶盖后用封口膜密封。将萃取瓶置于固相微萃取装置中固定恒温70 ℃预热30 min，开启磁力搅拌（400 r/min），将萃取进样手柄插入顶空样品瓶中，推出萃取纤维头萃取40 min，缩回萃取纤维头，取出萃取手柄，插入至气相色谱系统进样口。

1.3 GC-MS 条件

根据徐宁等[37]方法对大球盖菇进行GC-MS 分析。CD-WAX 色谱柱（30.0 m×0.25 μm，0.25 mm，上海安谱实验科技股份有限公司）；柱内温度为60 ℃；进样口温度240 ℃；进样方式：无分流；载气高纯He（含有量99.99%）；载气气体体积流速0.98 mL/min；程序升温条件为初始温度60 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至140 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升至210 ℃，保持5 min，分析检测时间共50 min。电子轰击离子源：EI 源；离子源温度：150 ℃，接口温度：280 ℃；电子能量：70 eV；质核比扫描范围：35～350m/z。

1.4 数据处理

对GC-MS 的总离子流图中的各峰经NIST 谱库进行对所出峰的质谱图进行检索比对，确定挥发性化学成分的种类，并通过峰面积归一化法计算各化合物的相对百分含量。每组实验做三个平行，样品中挥发性化合物含量以平均值形式表示。采用JMP16 系统对大球盖菇菌盖和菌柄所含挥发性成分分别进行PCA 分析。

2 结果与分析

2.1 大球盖菇子实体菌盖和菌柄中主要挥发性化合物

大球盖菇子实体菌盖和菌柄的挥发性成分GC-MS总离子见图1。由表1 可知，从大球盖菇子实体的菌盖和菌柄中鉴定出的挥发性化合物成分组成种类及其含量存在差异。从大球盖菇菌盖中共鉴定出50 个挥发性化合物，主要包括11 种醇类，8 种酯类、5 种烷类、4种醛类、4 种酮类、3 种酰胺类、2 种酸类、2 种糖类、1 种醚类、1 种炔类、1 种吡啶类、1 种胺类、1 种吗啉类、6 种其他类化合物。菌盖中醇类化合物占整个挥发性化合物总比例的22%，其次为酯类、烷类化合物，分别占16%、10%；醛类、酮类、酰胺类、糖类和酸类化合物分别占8%、8%、6%、4%和4%。醛类化合物主要为双(2-甲基烯丙基)乙缩醛和十一醛，相对百分含量分别为2.25%和2.09%；酰胺类化合物主要为N-(4-环辛烯-1-基)乙酰胺，相对百分含量分别为2.92%；糖类化合物为2,4:3,5-二亚乙-l-木糖和1,2-O-亚异丙基-3-O-甲磺酰基-5-O-甲氧羰基-D-呋喃木糖，相对百分含量分别为3.19%和1.36%；酸类化合物为6-羟甲基-三环十二烷基醋酸和2-(羟基亚氨基)-己酸，相对百分含量分别为0.67%和0.24%；醚类化合物为十六烷基丙基醚，相对百分含量为2.56%；炔类化合物为1-十五炔，相对百分含量为1.67%；吡啶类化合物为4-甲磺酰基-3-硝基吡啶，相对百分含量为3.36%；胺类化合物为(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺，相对百分含量为1.42%；吗啉类化合物为4-[4-(1,2,4-恶二唑-3-基)-1,2,5-恶二唑-3-基]吗啉，相对百分含量为3.78%；其他化合物中2,2-二甲基-4,5-二(1-丙烯基)-1,3-二氧戊环、环氧呋隆和4-氨基-N2-(4-吡啶亚甲基)-呋咱-3-甲酰肼等相对百分含量较高，相对百分含量分别为2.39%、2.20%和1.93%。

从大球盖菇菌柄也共鉴定出50 种挥发性物化合物，包括11 种醇类，10 种酯类、6 种酮类、4 种烷类、4 种胺类、3 种酸类、2 种烯烃类、1 种醛类、1 种糖类、1 种咪唑类、1 种萘类、1 种呋喃类、1 种噻吩类、4 种其他类化合物。醇类化合物占挥发性化合物总比例22%，其次为酯类、酮类化合物，分别占20%、12%；胺类、烷类、酸类和烯烃类化合物分别占8%、8%、6%和4%。胺类化合物主要为2,3-二甲氧基苄胺和(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-甲基)-噻唑-2-胺，相对百分含量分别为3.13%和2.30%；酸类化合物为1-叔丁基-1-苯基-环己甲酸、甲基-4-丁基-2-氧代四氢-3-呋喃羧酸和2-羟基-6-甲基-3-环己烯-1-羧酸，相对百分含量分别为2.20%、2.20%和1.55%；烯烃类化合物为1,2-顺-1,5-反式-2,5-二羟基-4-甲基-1-(1-羟基-1-异丙基)-3-环己烯和6-乙氧基-9-硫代双环[3.3.1]-2-壬烯，相对百分含量分别为2.12%和1.96%；醛类化合物为2-丁基-2-庚烯醛，相对百分含量为1.71%；糖类化合物为环1,2:3,5-双(甲基硼酸)-α-D-呋喃木糖，相对百分含量为1.17%；咪唑类化合物为N,N′-硫羰基二咪唑，相对百分含量为1.47%；萘类化合物为(2α,3β,4α,8α)-2,3-二甲氧基十氢萘，相对百分含量为1.45%；呋喃类化合物为四氢-2,2-二甲基-5-(1-甲基乙基)-呋喃，相对百分含量为1.43%；噻吩类化合物为3-甲基-4-(苯硫基)-2-丙烯基-2,5-二氢噻吩，相对百分含量为2.89%；其他化合物中三环[5.1.0.0(3,5)]辛烷-2,6-二酮-1,3,4,5,7,8-六甲基-立体异构体和(E)-1-羟基-2,2-二甲基-2,5-二氢-1H-咪唑-4-甲醛肟等相对百分含量较高，相对百分含量分别为2.79%和2.01%。菌柄与菌盖中所检测出的化合物中醇类和酯类含量最高，酯类化合物具有水果的芳香味，酮类也具有果香味，大球盖菇鲜子实体具有清香味，可能是由于含有大量酯类和酮类化合物而成。

2.2 大球盖菇子实体菌盖和菌柄中主要挥发性化合物的比较

大球盖菇含有食用菌中大部分挥发性物质，醇类是主要呈香物质，酯类具有水果的芳香味，酮类化合物一般具有花香和果香风味，醛类化合物具有特殊的香气，多为花香及果香气味，较高碳位数的具有柑橘皮的香味，但所含特征性风味物质不一样。大球盖菇菌盖和菌柄所含挥发性化合物成分对比见图2。

2.2.1 醇类化合物的比较和分析

醇类化合物也是构成大球盖菇菌盖和菌柄挥发性成分的主要组成成分之一，大球盖菇菌盖和菌柄都鉴定出11 种醇类化合物，分别约占总挥发性成分的22%。顺式-1-环戊烯-3,4-二醇和4-哌啶醇是构成大球盖菇菌盖醇类化合物的主要成分，相对百分含量分别为3.79%和2.66%；3,4-二羟基-2-甲基吡啶-5-甲醇和2-(2,5-二甲基环戊基)-1-丙醇是构成大球盖菇菌柄醇类化合物的主要成分，相对百分含量分别为3.13%和2.62%。

2.2.2 酯类化合物的比较和分析

酯类化合物主要通过醇和酸的酯化反应产生。酯类化合物约占大球盖菇挥发性总化合物数量的18%。大球盖菇菌盖和菌柄分别鉴定出8 种和10 种酯类化合物，分别占总挥发性成分的16%和22%。马来酸二乙基己酯和(2-乙基己基)亚磷酸三酯是构成大球盖菇菌盖酯类化合物的主要成分，相对百分含量分别为6.84%和2.76%；3-甲基丁基-2-十三炔-1-富马酸酯和(8E)-10-甲基-8-十四烯酯是构成大球盖菇菌柄酯类化合物的主要成分，相对百分含量分别为1.66%和1.53%。

2.2.3 酮类化合物的比较和分析

酮类化合物约占大球盖菇挥发性总化合物数量的10%。大球盖菇菌盖和菌柄分别鉴定出6 种和4 种酮类化合物，分别占总挥发性成分的12%和8%。3,3-二甲基-1-(1-氧杂螺[4.5]癸-2-基)-2-丁酮和8-羟基-2,2,8-三甲基-5,9-癸二烯酮是构成大球盖菇菌盖酮类化合物的主要成分，相对百分含量分别为2.24%和1.86%；3-壬烯-2-酮和麝香酮是构成大球盖菇菌柄酮类化合物的主要成分，相对百分含量分别为3.16%和2.95%。

2.2.4 烃类化合物的比较和分析

烃类化合物包括烯烃类、烷烃类和芳香烃类化合物，也是构成大球盖菇挥发性成分主要组成之一。大球盖菇菌盖和菌柄分别鉴定出5 种和4 种烷烃类化合物，分别占总挥发性成分的10%和8%；大球盖菇菌盖还鉴定出1种炔烃类化合物，菌柄鉴定出2种烯烃类化合物，分别占总挥发性成分的2%和4%。[2-(戊氧基)乙基]环己烷和1R-乙酰氨基-2,3-顺式-环氧-4-顺式-甲酰氧-环己烷是构成大球盖菇菌盖烷烃类化合物的主要成分，相对百分含量分别为2.75%和1.72%；1-溴-5-甲基己烷和2,6,10,14-四甲基-7-(3-甲基-4-亚戊烯基)十五烷大球盖菇菌柄烷烃类化合物的主要成分，相对百分含量分别为2.40%和1.78%。

食用菌的挥发性成分主要包括八碳挥发性化合物和含硫化合物，还包括醇类、酯类、酸类和酮类等化合物，如1-辛烯-3-醇，1-辛烯-4-醇和3-辛烯-2-醇是大部分食用菌主要挥发性成分之一。陈万超等[18]对香菇的挥发性成鉴定可知，香菇挥发性成分主要包括八碳化合物、含硫化合物、醛类、醇类、酸类、酮类、吡啶和呋喃化合物，1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、3-辛酮、2-甲基-1-丁醇、2-乙基己醇、二甲基四硫、二甲基三硫、二甲基二硫、1,2,4-三硫戊烷等为主要特征性风味物质。余昌霞等[24]对草菇所含挥发性物质进行了分析，草菇挥发性成分主要是芳香族、烯烃类、醛类化合物，其次是醇类化合物、酮类化合物，特征挥发性物质为异戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、甲硫醇、2-戊基呋喃、二甲基硫醚等，二甲基硫醚是产生美拉德反应的成分之一。张宪臣等[20]对姬松茸挥发性成分研究发现，含有酯类、醛类、醇类、酚类、烯烃类、酮类、酸类、呋喃类和含氮杂环化合物等为挥发性物质，苯甲醛、己酸甲酯、丁酸甲酯、异戊酸甲酯、异戊酸、3-乙基-2,5-甲基吡嗪为主要特征性风味物质，且吡嗪类化合物具有低阈值、留香时间长等特点，具有明显焦香与谷物的香烤风味。张福生等[14]对羊肚菌挥发性成分研究发现，醛类、酮类、酯类、酸类、醇类、杂环类和烃类化合物为主要挥发性成分，其中醇类、醛类和酮类化合物占总挥发性化合物含量的60%～80%；2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醛、1-辛烯-3-醇、薄荷酮为主要特征性风味物质。本研究通过HS-SPME-GC-MS 对大球盖菇菌盖和菌柄的挥发性成分鉴定，结果可知大球盖菇的主要挥发性成分是醇类、酯类、酮类和醛类化合物，醇类化合物是主要呈香物质，酯类化合物具有水果的芳香味，酮类化合物一般具有花香和果香风味，醛类化合物具有特殊的香气，多为花香及果香气味，较高碳位数的具有柑橘皮的香味，其中3,4-二羟基-2-甲基吡啶-5-甲醇、4-哌啶醇、马来酸二乙基己酯、环己烷和3-壬烯-2-酮为主要挥发性成分。

2.3 大球盖菇子实体菌盖和菌柄的PCA 分析

对表1 中大球盖菇所含的挥发性成分进行PCA 分析，见图3。大球盖菇子实体所含的挥发性物质中，菌盖和菌柄第1主成分解释所有变量方差分别为54.3%和61.3%，第2 主成分解释所有变量方差分别为45.7%和38.7%。由图3 可知，在大球盖菇菌盖中，大部分挥发性成分聚集在第二象限和第四象限。在PCA1 上马来酸二乙基得分最高，亚磷酸十三烷酯得分最低；在PCA2上4-哌啶醇得分较高，1,4-二异丙基环己烷得分较低。在大球盖菇菌柄中，在PCA1 上3,4-二羟基-2-甲基吡啶-5-甲醇得分最高，硬脂醇乙酸酯得分最低；在PCA2上3-壬烯-2-酮得分较高，1,4-二异丙基环己烷得分较低。通过PCA 可了解大球盖菇所含不同挥发性成分之间的相关性，根据PCA 的基本原则，物质在得分图上距离越接近说明物质组分及含量的相似度越高。由此可知，菌盖挥发性成分在第二和第四象限聚集分布，菌柄挥发性成分在每个象限呈分散分布，说明大球盖菇菌盖和菌柄在挥发性成分组成上具有明显差异。

3 结论

本研究通过HS-SPME-GC-MS 技术分析了大球盖菇子实体菌盖和菌柄的挥发性成分。鉴定结果发现，大球盖菇总共鉴定出100 和挥发性化合物，其中菌盖和菌柄都分别鉴定出50 个挥发性化合物，菌盖和菌柄的PCA 的结果说明了挥发性成分和含量上存在明显差异。其中醇类、酯类、烷类和酮类化合物相对百分含量较高，说明醇类和酯类是大球盖菇的主要特征性风味物质，3,4-二羟基-2-甲基吡啶-5-甲醇、4-哌啶醇和马来酸二乙基己酯相对百分含量最高。但此次研究有些食用菌特征风味物质未检出，可能与大球盖菇的品种、种植采收方式及样品处理方式有关。如1-辛烯-3-醇（蘑菇醇），可能是由于醇类物质容易分泌于胞外，在采收后的保藏运输和干制过程导致了流失而致。本研究通过对大球盖菇不同部位的挥发性物质进行研究，明确了不同部位的主体挥发性物质，这些成分如何影响大球盖菇风味形成还需进一步研究确认，但对建立大球盖菇特征风味指纹图谱，并以风味为育种过程中考察的重要农艺性状之一，对定向选育大球盖菇新品种具有重要意义。