隆林黄牛、涠洲黄牛冷冻精液制作的研究

文│邓祝新 黄丽云 刘瑞鑫 许春荣 王英群 洪少锋 李美珍 何复明 许鹏 方奕雄 蒋世强 魏莎*（广西壮族自治区畜禽品种改良站）

广西壮族自治区畜禽品种改良站积极响应国家政策的号召，打好种业翻身仗，积极推进《广西地方家畜品种遗传材料采集与保存》项目。其中，对广西地方品种进行遗传材料采集，并且获得了明显的成效，对广西畜牧种业做出重要贡献。隆林黄牛、涠洲黄牛具有以下特性：

（1）两者属于放养型黄牛，野性比较强，人工比较难驯服，增加了人工采精的难度。

（2）两者饲养基本都是单纯以进食青草为主，性欲差，精液稀。究其原因，为提高公牛性欲和精液量，在公牛饲养中进行圈养、隔离调教，增加蛋白性饲料投入，最终达到预期效果。鲜精活力完全达到制作冷冻精液的要求。

一、黄牛鲜精的采集

使用法国卡苏公司专售的IMV采精筒，用75%的酒精进行全面消毒，晾干，装好后备用。采精筒水温控制在45～50℃，内胎气压要充足，充满整个采精筒内胎，最好形成三角形裂口，涂少量专用润滑剂在采精筒内壁，保护公牛阴茎插入时不受伤。固定好台牛，等待公牛爬跨时，采精员迅速将采精筒套入公牛阴茎，收集牛精，待公牛下滑时拿开采精筒。采集结束后放水，排气压。取出集精杯，将精液送到实验室窗口内，浸泡在37℃的恒温水浴锅内。注意事项：如果采精筒的水温低于45℃或高于50℃时采精筒的内胆温度并不合适牛阴茎的感受温度，严重影响精液采集是否成功，甚至让公牛发怒，产生抵触不再爬跨。如果内胆温度过高，在采集牛精的同时部分精液流经内胆时，精子会因温度过热而被烫死一部分，人为造成损失。

二、黄牛鲜精的镜检与稀释

1.黄牛鲜精稀释液直接采用了法国卡苏公司的产品（BIOXCELL freezing medium for bull semen，稀释液250 毫升/瓶）。必须使用双蒸高压灭菌蒸馏水，按照1∶4的比例配制等温混合均匀后放置于35℃的恒温水浴锅内待用。

2.接到集精杯后轻轻摇匀精液，用肉眼观察精液颜色是否有异常或杂质。合格的精液做好采精记录，取10微升原精进行显微镜镜检，观察精液情况，活力达到0.7以上且无杂质、无污染、死精少的原精可以使用（一般鲜精活力在0.6以下的不建议制作冷冻精液），接着用密度仪测量精子密度，2.4毫升（0.9%氯化钠）＋100微升的原精，放到比色皿中摇匀，放入卡苏IMV光谱密度仪中测量，按照密度仪的提示量进行稀释。重点要求：

（1）稀释过程中一边摇匀一边取样镜检观察精子情况，直到稀释合适为止，加稀释液总量一般不超过推荐量。

（2）稀释液和牛精液要同时浸泡在37℃的水浴锅中，以达到两者温度一致，在稀释时减少温差对精子活力的影响。

（3）稀释完成后，将精液浸泡在水浴锅中等待分装，稀释间的室温要求在25℃左右，稀释后的精液温度基本维持在26℃左右，目的是让精子从采集出来到稀释完成的整个过程中逐级降温。稀释后要求每支0.25毫升细管内总精子数在3000万以内，有效精子数为800～1000万个，少于800万个有效精子数的为不合格产品。

三、黄牛鲜精的灌装与平衡

稀释后的牛精液分装到0.25毫升容量的细管中，笔者使用法国卡苏公司生产的IS4全自动精液灌装一体机、多米诺A系列喷码机，联合灌装成产品。每支0.25毫升细管内有效精液含量在0.185～0.21为合格产品。重点要求：

（1）灌装的同时必须摇匀精液，达到分装均匀的效果。

（2）精液灌装的室温控制在23～25℃为佳，让精液再次逐级降温。防止精液温度回升，如果温度回升会对精液造成不可逆转的损伤。

平衡的要求：灌装完成后的细管精液从25℃左右的室温立即放到开放式的平衡柜内。此时平衡柜的工作温度为4～8℃。当所有细管精液在平衡柜内完成上托架、排管，约1小时稳定后，再把细管精液转移到4℃的密闭式恒温柜内静置3～4个小时。此时是最关键的精子休眠期，禁止再次打开恒温柜，防止精液回温。

四、黄牛冷冻精液的制作过程

经过3个小时以上的平衡后进行冷冻。打开电脑冷冻程序，打开冷冻仪，开启液氮阀门，并检查液氮压力，选择牛冷冻精液制作专用程序，点击进入冷冻程序。当冷冻程序提示冷冻柜达到4℃时迅速打开冷冻柜盖子，将平衡好的细管精液放入冷冻柜对应的架子上，然后盖上盖子。等待约2分钟后点击开始冷冻。约7.5分钟后冷冻结束，此时关掉风扇，戴上手套，取出细管冻精，迅速浸泡到液氮容器中，产品成型，冷冻结束。

五、黄牛冷冻精液的解冻与活率观察

1.细管冻精的解冻检查。将水浴锅温度调节至38℃，用温度计测量实际水温，38～39℃为最佳解冻温度。选择5毫升指型管，加入1毫升牛冻精解冻液，置于水浴锅架子上浸泡，将一支冷冻精液取出，迅速浸泡到水浴锅中解冻，均匀摇晃30秒以上，待溶解完后取出，擦干细管表面水分，减掉封口端，将精液完全挤到指型管解冻液内，水浴摇均匀，用移液枪取10微升进行镜检观察。重点要求：解冻时，细管必须水浴摇晃，解冻时间30秒以上。水温必须恒定在38～39℃，显微镜观察时载物台必须配备恒温板。一块玻片分别取3滴10微升精液在3个视野下进行观察，综合评定活力。0.35或0.35以上为合格，否则为不合格。

2.生产制作要点。

（1）采精工作中控制采精筒的内胆水温才能采到好的精液。否则，黄牛爬跨时只射精清，并不是真正射精，导致采不到精液。

（2）在精液稀释工作中，首先将鲜精摇匀，精液取样位置不同，对精子密度测量值会有一定偏差，因此，在实际工作中一定要将理论值与实际值相结合，反复镜检看稀释效果。

（3）必须做到逐级降温，这是鲜精稀释后最重要的部分，严格逐步降温过程，禁止回温，防止造成不可逆的损伤。平衡温度严格要求在4℃，平衡时间要求稳定在3～4小时后才能进行冷冻制作。经测试，解冻温度为38～39℃最合适，必须采取水浴解冻，将整支精液完全挤到解冻液内摇匀，取10微升滴片，镜检观察活力。多看几个视野内的精子，采取综合评定。隆林黄牛、涠洲黄牛的公牛采集到的原精活力基本都在0.7以上，个别公牛原精偏稀，饲养管理过程中多增加精料，多运动，坚持公牛分栏饲养，以采到更好的精液，才能制作出更完美的冻精。