海洋杆菌糖基转移酶Agt突变体的制备及其在单葡萄糖甘油二酯催化合成中的应用

张志平，赵雨哲，赵彩梦，杨旭，魏涛

(郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001)

甘油糖脂是糖与1, 2-二酰基-sn-甘油通过糖苷键连接而成的化合物，其单糖或寡糖附着在甘油主链的sn-3位置，主要存在于海藻[1-3]、蓝细菌[4-6]及高等植物中。单葡萄糖甘油二酯(monoglucosyl diacylglycerol，MGlc-DAG)、1, 2-二酰基-3-O-β-D-吡喃型半乳糖基-甘油(monogalactosyldiacylglycerol，MGDG)、1, 2-二酰基-3-O-(α-D-吡喃型半乳糖基(1→6)-O-β-D吡喃型半乳糖基)-甘油(digalactosyldiacylglycerol，DGDG)和1, 2-二酰基-3-O-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖基)-甘油(sulfoquinovosyldiacylglycerol，SQDG)是海洋蓝藻和叶绿体中常见的4种甘油糖脂[7]。在其他细菌中也发现了多种甘油糖脂，在这些甘油糖脂中，糖供体(除了半乳糖和葡萄糖)主要以α-或β-异聚体的形式结合在(1→2)，(1→3)，(1→4)或(1→6)链中[8]。此外，从天然产物中鉴定出一些独特类型的甘油糖脂，包括氨基甘油糖脂[9]、醚键甘油糖脂[10]和葡萄糖醛酸甘油脂[11]。甘油糖脂具有多种生物活性和药理活性，如抗肿瘤[12-13]、抗氧化[14]、抗病毒[15]和抗炎[16]等，可广泛应用于制药工业，已成为业界研究热点。

常见的植物提取方法为Floch液-液萃取法，该方法使用有机溶剂氯仿/甲醇进行萃取[17]，操作步骤较为繁琐，所提取的产物中甘油糖脂含量少、纯度低、杂质(中性脂、游离脂肪酸和磷脂等)多[18]。化学合成法对反应条件和分离设备要求高，副产物较多，目标产品不易分离，产生的废液污染性强。生物酶法制备甘油糖脂，具有反应步骤较少，转化率高、纯度高等优势，有良好的工业应用前景。根据已有文献报道和课题组前期研究，海洋杆菌Candidatuspelagibactersp.HTCC7211中的糖基转移酶Agt具有催化合成不同甘油糖脂活性，其中以二磷酸尿苷-葡萄糖(uridine diphosphate gluscose,UDP-Glu)和甘油二酯为底物合成单葡萄糖甘油二酯的活性最高；生物信息学分析结果也表明保守丝氨酸Ser257与酶和底物结合活性有关[19-20]。因此本文尝试构建海洋杆菌糖基转移酶Agt突变体，获得高活性突变体酶，进而研究以UDP-Glu和甘油二酯为底物合成单葡萄糖甘油二酯，以期为甘油糖脂合成新方法和工业化应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株与质粒

海洋杆菌Candidatuspelagibactersp.HTCC7211，感受态细胞EscherichiacoliDH5α和E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL，克隆与表达载体pET15b和重组质粒pET15b/Agt，均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

dNTP、ProbestTMDNA聚合酶、限制性内切酶NdeI及SalI，日本宝生物(大连)公司；DNA连接试剂盒kit ver.2.1、细菌基因组DNA提取试剂盒kit ver.3.0，TaKaRa公司；氨苄青霉素、氯霉素、咪唑、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris]、甘氨酸(电泳级)，美国BBI公司；蛋白Marker，美国Thermo Scientific公司；Ni-NTA 琼脂糖，Qiagen公司；UDP-Glu、甘油二酯(diacylglycerol，DAG)、MGlc-DAG、MGDG，美国Sigma公司。

1.1.3 主要仪器

SW-CJ-1F型超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；J6-MI型超低温离心机，美国Beckman公司；JY92-II DN型超声波细胞粉粹机，宁波新芝生物科技股份有限公司；JB-680B型全自动凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司；UV-2006型紫外可见分光光度计，上海仪器有限公司；德国默克硅胶板60，北京丰美天合科技有限公司；瑞士CAMAG自动TLC取样器Ⅲ，上海艾研生物科技有限公司；TLC Scanner 4型CAMAG薄层色谱扫描仪，上海智岩科学仪器有限公司；CMax Plus型SpectraMax微孔读板机，北京五洲东方科技发展有限公司；Agilent Technologies 1290 Infinity II UPLC型超高效液相色谱，美国Agilent公司；AB SCIEX Triple QuadTM 5500型质谱仪，AB SCIEX公司；Nanodrop 2000型微量紫外分光光度计，美国Thermo Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糖基转移酶Agt突变体重组质粒的构建

前期利用生物信息学和蛋白质结构模拟分析发现，C.pelagibactersp.HTCC7211糖基转移酶Agt和其同源物中，氨基酸残基Ser257为高度保守位点，可能与底物UDP-Glu和甘油二酯结合有关，本研究尝试构建糖基转移酶Agt点突变体(T257A、T257I、T257S、T257D和T257K)[19-20]，具体方法如下：使用重叠延伸PCR法构建糖基转移酶Agt突变体质粒，以pET15b/Agt重组质粒为模版，设计上下游引物(表1)进行突变片段PCR，将突变基因片段重新克隆到pET15b载体中以获得突变体重组质粒。PCR反应体系(50 μL)为：模板1 μL(25 ng)，dNTP (25 mmol/L)2 μL，引物(100 μmol/L)各1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，10×缓冲液 5 μL，ProbestTMDNA聚合酶 (5U/μL)1 μL，超纯水37 μL。第一轮PCR反应模板为质粒pET15b/Agt，第二轮PCR反应模板为第一轮PCR产物。具体PCR反应条件为：第一轮：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环。第二轮：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环。

表1 糖基转移酶Agt突变体构建上下游引物Table 1 Synthetic oligonucleotide primers used for construction of glycosyltransferase Agt

1.2.2 野生型糖基转移酶Agt及其突变体基因的诱导表达和纯化

将野生型糖基转移酶Agt基因质粒与上述合成的突变体重组质粒分别转化到E.coliBL21-codonPlus(DE3)-RIL中，取单菌落在已加入100 mg/L氨苄青霉素及34 mg/L氯霉素的LB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L)中培养，当OD600达到0.4～0.6时，加入0.5 mmol/L IPTG诱导表达，10 h后收集菌体，经离心后超声破碎，收集上清液，随后采用镍柱亲和层析(洗脱缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9，500 mmol/L NaCl, 300 mmol/L 咪唑, 1% Triton X-100)和Superdex-200(16/60)凝胶过滤柱(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9，200 mmol/L NaCl；洗脱速度0.5 mL/min)进行纯化，得到野生型糖基转移酶Agt以及重组突变体酶，使用SDS-PAGE法检测纯化后的目标蛋白。

1.2.3 野生型Agt与突变体酶活性分析

以UDP-Glu和甘油二酯为底物，不含有酶的反应体系作为空白对照组，野生型Agt与突变体酶作为实验组进行酶活性分析。酶活力标准反应体系(1 mL)为：0.1 mmol/L UDP-Glu、0.1 mmol/L甘油二酯、2.0 μmol/L纯化蛋白和50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)反应缓存液[19-20]。将反应体系于35 ℃恒温下200 r/min恒定孵育20 h，采用Floch法以V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2提取反应产物，并使用薄层层析TLC法分离反应产物，随后使用液质联用LC-MS方法检测反应产物。酶活力单位的定义：一个酶活力单位为在标准条件下每分钟催化合成1 μmol的单葡萄糖甘油二酯所需的酶量。

1.2.4 反应产物甘油糖脂的分离提取

采用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2和V(环己烷)∶V(乙酸乙酯)分别为1∶1，1∶2，1∶4，1∶6复提反应产物。具体操作流程如下：取1 mL酶催化所得反应产物，加入1 mLV(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2剧烈振荡45 s后于3 000 r/min离心5 min，提取液分层后，糖脂溶于下层有机相中，收集下层有机相。将上层溶液加入V(环己烷)∶V(乙酸乙酯)分别为1∶1，1∶2，1∶4，1∶6溶液中重新提取，合并2次提取样品，得到反应产物。按公式(1)计算提取率：

(1)

1.2.5 薄层层析方法分析检测反应产物

使用CAMAG自动TLC取样器III对提取的糖脂进行薄层层析(thin layer chromatography，TLC)分析。在硅胶板60上用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶35∶4进行分离，并用V(硫酸)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10进行染色，观察合成的糖脂化合物。

1.2.6 液质联用(LC-MS)方法分析检测反应产物

将TLC检测后获得的糖脂产物溶解于有机溶剂[V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(乙腈)=6∶3∶1]中，采用LC-MS检测产物结构。使用BEH Amide XP色谱柱(内径2.5 μm，3 mm×150 mm，Waters，USA)进行色谱分离。LC-MS检测流动相为溶剂A-乙腈，溶剂B-pH 9.2的10 mmol/L乙酸铵。进样前先使用V(溶剂A)∶V(溶剂B)=95∶5平衡色谱柱10 min，15 min后，使用从V(溶剂A)∶V(溶剂B)=95∶5到V(溶剂A)∶V(溶剂B)=70∶30逐步梯度进行分离，恒定流速为150 μL/min。质谱分析条件为：ESI正离子模式，离子喷雾电压3 500 V，温度350 ℃。雾化器气体以及加热器气体40 psi。

1.2.7 糖基转移酶Agt突变体酶最适反应条件分析

1.2.7.1 最适酶浓度确定

以UDP-Glu和甘油二酯为底物，分别加入不同浓度的突变体酶进行反应，测定单葡萄糖甘油二脂的产量。

1.2.7.2 最适底物浓度确定

在最适酶浓度作用下，分别加入不同浓度的UDP-Glu作为底物进行反应，测定单葡萄糖甘油二脂的产量。

1.2.7.3 最适反应温度确定

在最适酶浓度和底物浓度条件下，以Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.5)为缓冲体系，将一定量的突变体酶与底物分别于10～50 ℃条件下反应(温度梯度为5 ℃)，在水浴振荡24 h后，测定突变体酶的酶反应活力。

1.2.7.4 最适反应pH确定

使用50 mmol/L的不同pH(6.0～11.0)缓冲体系：磷酸钠缓冲液(pH 6.0～7.5)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.5～9.5)和3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS，pH 9.5～11.0)，将一定量酶加入到上述不同pH缓冲液中反应1 h，分别测定酶活力。

1.2.7.5 最适反应条件下突变体酶催化合成单葡萄糖甘油二酯的反应

在上述确定的突变体酶各项最适条件下进行催化反应，测定催化产物单葡萄糖甘油二酯的产量，计算转化率。

2 结果与分析

2.1 野生型糖基转移酶Agt及其突变体酶的表达

海洋杆菌C.pelagibactersp.HTCC7211糖基转移酶Agt及其突变体酶(T257A、T257I、T257S、T257D和T257K)重组质粒在E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL表达后，经镍柱亲和层析和分子筛Superdex-200(16/60)凝胶过滤柱，获得纯化后的突变体酶，SDS-PAGE电泳分析表明，突变体酶的分子质量约为38 kDa(图1)。

M-蛋白Marker；1-全蛋白；2-上清蛋白；3-纯化后的糖基转移酶Agt；4-8-分别为纯化后的突变体酶(T257A、T257I、T257S、T257D以及T257K)图1 纯化后的野生型糖基转移酶Agt及其突变体酶的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified glycosyltransferase Agt mutant enzymes and wild type control

2.2 野生型糖基转移酶Agt及其突变体酶动力学分析

kcat/Km值是衡量酶催化效率的重要参数，通过测定不同突变体的kcat/Km值，进而表征酶催化效率的变化情况。以UDP-Glu及甘油二酯为底物，对比分析野生型糖基转移酶Agt及其突变体酶的动力学常数，结果如表2所示。突变体T257S的kcat/Km值为(111.9±1.9) L/(mmol·min),是野生型酶Agt(71.4±2.7) L/(mmol·min)的1.56倍，由此可知突变体T257S催化效率相对于野生型酶Agt显著提高；其他突变体T257A、T257I、T257D和T257K催化合成单葡萄糖甘油二酯效率均有所降低。推测原因，突变体T257S突变的位点可能有效改变酶的活性中心微环境，与Thr相比，Ser缺少一个亚甲基，因此Ser残基与底物之间可能会有更多的结合空间，利于Ser残基与糖供体UDP-Glu间的相互作用[21-22]。上述结果表明，与野生型酶Agt相比，突变体T257S具有更高的催化活性和催化效率，因此，选用突变体T257S催化合成单葡萄糖甘油二酯。

表2 野生型糖基转移酶Agt与突变体酶动力学参数分析aTable 2 Kinetic parameters of purified glycosyltransferase Agt mutant enzymes and wild type controla

2.3 突变体酶T257S反应产物提取方法的优化结果

甘油糖脂常采用Floch液-液萃取法，选用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2为提取液，然而，该方法所提产物中含有一定量的中性脂、游离脂肪酸和磷脂等杂质，往往需要进一步采用薄层色谱法/固相萃取/高效液相色谱法等来分离纯化[17-18]。本文研究了传统氯仿/甲醇法与不同体积比环己烷/乙酸乙酯重复提取的效果，各种方法对T257S反应产物提取率的比较结果如图2所示。结果表明，单采用氯仿/甲醇法的提取率仅为42.2%，而通过环己烷/乙酸乙酯复提后的产物提取率均有所提高，特别是采用V(环己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶4复提后，产物提取率可达84.7%。因此V(环己烷)∶V(乙酸乙酯)=1∶4复提产物的得率约是单纯采用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2法的2倍。

图2 对比分析环己烷/乙酸乙酯和氯仿/甲醇方法提取反应产物Fig.2 Comparative analysis of reaction products extracted by the methods cyclohexane/ethyl acetate and chloroform/methanol

2.4 TLC方法分离T257S反应产物

TLC能够分离、定性分析出多种新的糖脂。对有机萃取获得的高纯产物进行薄层色谱分析，结果如图3所示，使用V(硫酸)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10染色后，对照标准品可知，实验组均为单条带，反应产物为单葡萄糖甘油二酯，表明突变体酶T257S可以利用UDP-Glu和甘油二酯为底物合成单葡萄糖甘油二酯。

1-单葡萄糖甘油二酯和MGDG标品；2-未加酶的对照组；3,4-加入突变体酶后的催化合成产物图3 糖基转移酶Agt突变体T257S合成单葡萄糖甘油二酯的TLC结果Fig.3 TLC results for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.5 LC-MS法检测T257S反应产物

采用LC-MS法进一步鉴定甘油糖脂结构。在正离子扫描模式下检测结果如图4所示，突变体酶T257S催化反应产物中获得单葡萄糖甘油二酯的特征碎片图谱，甘油二酯为m/z577.4、甘油单酯(甘油-16∶0)为m/z313.3，甘油单酯(甘油-18∶1)为m/z339.3，单葡萄糖甘油二酯母离子为m/z774.3。进一步证明了糖基转移酶突变体T257S合成产物为单葡萄糖甘油二酯，具体生物催化反应式见图5。

图4 糖基转移酶Agt突变体T257S合成单葡萄糖甘油二酯的二级质谱结果Fig.4 Secondary mass spectrometry results for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

图5 糖基转移酶Agt突变体T257S合成单葡萄糖甘油二酯催化反应式Fig.5 Reaction scheme for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.6 糖基转移酶突变体T257S最适反应条件分析

2.6.1 突变体酶最适酶浓度和最适底物浓度

突变体酶最适酶浓度及底物浓度见图6。

图6 糖基转移酶Agt突变体T257S的最适反应酶浓度(a)和底物质量浓度(b)Fig.6 Optimal enzyme concentration (a) and substrate concentration (b) for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

由图6-a可以看出，单葡萄糖甘油二酯在糖基转移酶突变体T257S酶浓度为8 U/mL时产率最高；由图6-b可以得出，单葡萄糖甘油二酯在底物UDP-Glu质量浓度为500 mg/L时产率最高。

2.6.2 突变体酶最适反应温度和最适反应pH

如图7-a所示，随着温度的升高，酶活性也逐渐提高，当反应温度到达35 ℃时，突变体酶T257S活性最高，温度超过35 ℃酶活性逐渐降低，因此突变体酶T257S的最适反应温度为35 ℃。如图7-b所示，当pH在8.5时，突变体T257S的相对酶活性较高，因此突变体酶T257S最适反应pH为8.5。

图7 糖基转移酶Agt突变体T257S的最适温度(a)和最适反应pH(b)Fig.7 Optimal temperature (a) and pH (b) for the synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt

2.6.3 最适反应条件下突变体酶T257S催化合成单葡萄糖甘油二酯的反应

突变体酶T257S合成单葡萄糖甘油二酯的最佳反应条件为：酶浓度8 U/mL、UDP-Glu质量浓度500 mg/L、温度35 ℃和pH 8.5。最佳条件下反应20 h，突变体酶T257S催化合成单葡萄糖甘油二酯的结果如图8所示。突变体酶T257S在反应8 h后以68.5%的转化率合成单葡萄糖甘油二酯(424.5 mg/L)；在初始500 mg/L的反应中，酶在8 h内消耗的UDP-Glu为365 mg/L(0.59 mmol/L)，根据转化化学计量法，理论生成单葡萄糖甘油二酯应为452.2 mg/L，转化率为68.5%。单葡萄糖甘油二酯在反应溶液中随时间分解，表明产物不稳定且可能易氧化。整个反应过程中，单葡萄糖甘油二酯的损失量约为27.7 mg/L，进而计算得出反应生成单葡萄糖甘油二酯纯度为93.8%，表明突变体酶T257S具有较高的催化UDP-Glu和甘油二酯合成单葡萄糖甘油二酯的活性，可作为生物技术应用中酶转化合成单葡萄糖甘油二酯的备选酶源。

图8 最适反应条件下突变体酶T257S催化合成单葡萄糖甘油二酯Fig.8 The synthesis of monoglucosyl diacylglycerol by the mutant T257S of glycosyltransferase Agt under optimal reaction conditions

3 结论与讨论

甘油糖脂具有抗肿瘤、抗病毒和抗炎等生物活性，相关研究已经引起人们的广泛关注。本研究在前期发现海洋细菌C.pelagibactersp.HTCC7211中一个高效催化合成单葡萄糖甘油二酯的甘油糖脂合成酶Agt的基础上，对该酶进行分子改造，构建了系列突变体酶表达质粒，并成功实现了宿主表达；相对于野生型甘油糖脂合成酶Agt，突变体T257S的催化效率显著提高；进一步采用传统氯仿/甲醇法结合环己烷/乙酸乙酯复提产物，有效提高了产品提取效率；在确定突变体酶最佳反应条件的基础上，反应产物单葡萄糖甘油二酯纯度可达93.8%。本研究为国内外首次采用生物酶法成功制备高纯度的单葡萄糖甘油二酯。

综上所述，通过C.pelagibactersp.HTCC7211中的甘油二脂合成酶Agt基因构建并表达的单葡萄糖甘油二酯合成酶突变体T257S具有较高的生物催化活性，可高效催化UDP-Glu和甘油二酯合成高纯度单葡萄糖甘油二酯，适用于单葡萄糖甘油二酯生物酶法制备，具有较高的研究价值及广泛的工业应用前景。