纳扎替尼调控miR-940/JAK2/STAT3途径对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

杨彦茹 李淑珍 钱佳佳 （乌兰察布医学高等专科学校药学检验系，乌兰察布 012000）

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命健康。依据病理类型的不同，可将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占肺癌患者的80%～90%［1］。目前，肺癌的治疗主要以手术联合放化疗为主，早期肺癌治疗疗效较佳，而多数患者确诊时已处于中晚期，五年生存率低于50%，因此，需要寻找更有效且安全的治疗方法［2］。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EG⁃FR）是一种受体型酪氨酸激酶，其异常活化和过表达可引起肿瘤的发生和发展，因此，靶向EGFR 小分子抑制剂成为肿瘤治疗的重要策略之一［3］。纳扎替尼（nazartinib）是第三代表EGFR酪氨酸激酶抑制剂，是目前正在开发和临床测试的用于治疗非小细胞肺癌的候选药物［4］。微小RNA（miRNA）是一类参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生命过程的小分子非编码RNA，在肿瘤的发生发展中起重要作用，是肿瘤治疗的潜在分子靶点。研究显示，miR-940 在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中的表达明显低于癌旁组织，且miR-940 高表达的NSCLC 患者总生存率明显高于miR-940 低表达患者，过表达miR-940 靶向抑制FAM83F 的表达降低了肺癌细胞的增殖能力［5］。因此，本研究以肺癌细胞NCI-H2170 为研究对象，旨在观察nazartinib 对NCI-H2170细胞增殖和凋亡的影响及其能否通过调控miR-940 发挥作用，以期为nazartinib 在临床中的应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 肺癌细胞系NCI-H2170（中国科学院上海细胞库）；nazartinib（美国Selleck 公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技公司）；RPMI 1640 培养基、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；LipofectamineTM2000试剂盒和Trizol试剂（美国Invitrogen 公司）；miR-940抑制剂（anti-miR-940）、抑制剂阴性序列（anti-miRNC）和PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的半胱天冬酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）；逆转录试剂盒和PCR 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 复苏NCI-H2170细胞，用含10%FBS 的RPMI1640 培养基培养。将NCIH2170 细胞以2.5×105个/孔NCI-H2170 细胞接种于6 孔板中，用LipofectamineTM2000 脂质体法，分别转染anti-miR-940、anti-miR-NC。转染6 h 后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组处理 未转染的细胞分为对照组（NC组）、不同剂量nazartinib组，其中NC组细胞常规培养，nazartinib 组细胞分别用含1、2、4、8、16 nmol/L nazartinib 的培养基培养。转染anti-miR-NC、antimiR-940 的细胞常规培养基培养，记为anti-miR-NC组、anti-miR-940 组。转 染anti-miR-NC、anti-miR-940 的细胞用含8 nmol/L nazartinib 的培养基培养，记为nazartinib+anti-miR-940组、nazartinib+anti-miRNC组。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖 细胞以2.5×104个/孔接种于96 孔板中，按1.2.2 分组处理。培养24 h后，10 µl/孔加CCK-8 试剂。再孵育2 h，酶标仪450 nm测光密度（OD）值。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞以5.0×104个/孔接种于24 孔板中，按1.2.2 分组处理。培养24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，参照Annexin V-FITC/PI 试剂盒说明书操作步骤，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 Western blot 法 检 测CyclinD1、Cleavedcaspase-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达 细胞以5.0×104个/孔接种于24 孔板中，按1.2.2 分组处理。培养24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，RIPA试剂提取细胞中总蛋白。BCA 法对测定蛋白含量，行10% SDS-PAGE 电泳。电泳后，湿转至PVDF 膜，并于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。然后分别置于CyclinD1（1∶500）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、p-JAK2（1∶500）、p-STAT3（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。再置于山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育液中，37 ℃孵育1 h。最后加显影液，避光显影后曝光拍照。

1.2.6 RT-qPCR 检测miR-940 表达 细胞以5.0×104个/孔接种于24 孔板中，按1.2.2 分组处理。培养24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，用Trizol 试剂提取细胞中总RNA。将RNA 逆转录为cDNA，行PCR 扩增。扩增程序：95 ℃3 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35个循环。引物序列：miR-940正向5'-GTATAAAGGGCCCCCGCT-3'，反向5'-AGGGTCCGAGGTATTCGCACT-3'；U6 正 向5'-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3'，反 向 5'-TGAC⁃GCTTGCCCACAGCCTT-3'。2-ΔΔCt法计算miR-940 相对于内参U6的表达水平。

1.3 统计学分析 SPSS22.0 软件分析实验数据。计量资料以±s表示。两组间比较用独立样本t检验；多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 nazartinib 对NCI-H2170 细胞增殖的影响 与NC 组比较，不同浓度（1、2、4、8、16 nmol/L）的nazar⁃tinib降低了NCI-H2170细胞OD值及细胞中CyclinD1蛋白表达（P＜0.05，图1、表1）。16 nmol/L与8 nmol/L对NCI-H2170 细胞增殖抑制率的影响无差异，说明8 nmol/L 已达到抑制率最大值，因此后续实验未设计16 nmo/L浓度。

表1 Nazartinib对NCI-H2170细胞OD值的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of nazartinib on OD value of NCI-H2170 cells（±s，n=9）

表1 Nazartinib对NCI-H2170细胞OD值的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of nazartinib on OD value of NCI-H2170 cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

OD value 1.158±0.10 0.928±0.091）0.769±0.071）0.604±0.061）0.524±0.051）0.532±0.041）112.006 0.000 Groups NC 1 nmol/L nazartinib 2 nmol/L nazartinib 4 nmol/L nazartinib 8 nmol/L nazartinib 16 nmol/L nazartinib FP

图1 Nazartinib对NCI-H2170细胞中CyclinD1蛋白表达的影响Fig.1 Effects of nazartinib on protein expression of CyclinD1 in NCI-H2170 cells

2.2 nazartinib 对NCI-H2170 细胞凋亡的影响 与NC 组比较，不同浓度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib提高了NCI-H2170 细胞凋亡率及细胞中Cleavedcaspase-3蛋白表达（P＜0.05，图2、表2）。

表2 Nazartinib对NCI-H2170细胞凋亡率影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of nazartinib on apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

表2 Nazartinib对NCI-H2170细胞凋亡率影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of nazartinib on apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Apoptosis rate/%7.69±0.75 12.53±1.131）18.03±1.641）24.83±2.311）28.36±2.431）206.724 0.000 Groups NC 1 nmol/L nazartinib 2 nmol/L nazartinib 4 nmol/L nazartinib 8 nmol/L nazartinib FP

图2 Nazartinib 对NCI-H2170 细胞凋亡及Cleavedcaspase-3蛋白表达的影响Fig.2 Effects of nazartinib on apoptosis of NCI-H2170 cells and protein expression of Cleaved-caspase-3

2.3 nazartinib 对NCI-H2170 细胞中miR-940 表达的影响 与NC 组比较，不同浓度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib 提高了NCI-H2170细胞中miR-940表达（P＜0.05，图3）。

图3 Nazartinib对NCI-H2170细胞中miR-940表达的影响Fig.3 Effects of nazartinib on expression of miR-940 in NCI-H2170 cells

2.4 nazartinib 对NCI-H2170 细 胞 中JAK2/STAT3信号通路的影响 与NC 组比较，不同浓度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib 降 低 了NCI-H2170 细 胞 中p-JAK2和p-STAT3蛋白表达（P＜0.05，图4）。

图4 Nazartinib 对NCI-H2170 细 胞 中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达的影响Fig.4 Effects of nazartinib on protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 in NCI-H2170 cells

2.5 敲 减miR-940 逆 转nazartinib 对NCI-H2170 细胞增殖、凋亡及JAK2/STAT3 信号通路的影响 与miR-NC inhibitor 组 比 较，miR-940 inhibitor 组NCIH2170 细 胞OD 值 及 细 胞 中CyclinD1、p-JAK2 和p-STAT3 蛋 白 表 达 升 高（P＜0.05），凋 亡 率 及Cleaved-caspase-3 蛋 白 表 达 降 低（P＜0.05）。与nazartinib+miR-NC inhibitor 组比较，nazartinib+miR-940 inhibitor 组NCI-H2170 细 胞OD 值 及 细 胞 中CyclinD1、p-JAK2 和p-STAT3 蛋 白 表 达 升 高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白表达降低（P＜0.05，图5、表3）。

图5 敲减miR-940 逆转nazartinib 对NCI-H2170 细胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达的影响Fig.5 Knockdown of miR-940 reverses effect of nazar⁃tinib on protein expressions of CyclinD1，Cleavedcaspase-3，p-JAK2 and p-STAT3 in NCI-H2170 cells

表3 miR-940 逆 转nazartinib 对NCI-H2170 细 胞OD 值和凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of miR-940 reverses effect of nazar⁃tinib on OD value and apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

表3 miR-940 逆 转nazartinib 对NCI-H2170 细 胞OD 值和凋亡率的影响（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of miR-940 reverses effect of nazar⁃tinib on OD value and apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

Nore：Compared with miR-NC inhibitor group，1）P＜0.05；compared with nazartinib+miR-NC inhibitor group，2）P＜0.05.

Apoptosis rate/%7.72±0.71 2.46±0.141）27.39±2.111）10.06±0.912）723.468 0.000 Groups miR-NC inhibitor anti-miR-940 nazartinib+miR-NC inhibitor nazartinib+miR-940 inhibitor FP OD value 1.143±0.11 1.432±0.121）0.540±0.051）1.024±0.092）134.044 0.000

3 讨论

作为一种新型的EGFR 酪氨酸激酶小分子抑制剂，nazartinib 对突变型EGFR 具有选择性抑制作用，且在体内耐受性良好，并具有良好的安全性［6］。目前，nazartinib 对肿瘤细胞恶性行为影响的相关研究还比较少见。本研究显示，不同浓度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib 可降低肺癌细胞NCI-H2170 的OD 值，而提高其凋亡率，说明nazartinib 抑制了肺癌细胞增殖，且促进细胞凋亡。

细胞增殖紊乱和凋亡受阻是肿瘤的重要发病机制，抑制肿瘤细胞增殖且诱导其凋亡是肿瘤治疗的重要途径。CyclinD1 是细胞周期调控分子，其可促进细胞快速通过G1 期，加速G1 期/S 期转变进而促进细胞增殖［7］。Caspase 家族是一类天冬氨酸依赖的半胱氨酸蛋白水解酶，该级联反应是细胞凋亡过程的中心环节。Caspase-3 是caspase 级联反应的关键调控分子，其受到上游凋亡信号刺激后被激活，切割下游多种分子，进而诱导细胞凋亡［8］。本研究显示，nazartinib可降低NCI-H2170细胞中CyclinD1蛋白的表达，而促进Cleaved-caspase-3 蛋白表达，进一步说明nazartinib 可抑制肺癌细胞增殖，且加剧细胞凋亡。

miRNA 是一类广泛存在于真核生物中约为18～25 个核苷酸的小分子非编码RNA，参与肿瘤的发生发展进程。miR-940 是miRNA 家族成员之一，其在乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤中表达上调，发挥促癌基因作用；而miR-940在食管鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、舌鳞癌和神经胶质瘤等肿瘤中表达下调，上调其表达可抑制肿瘤发展进程［9-15］。本研究显示敲减miR-940 促进了肺癌细胞NCI-H2170 增殖，且抑制了其凋亡，与JIANG 等［13］报道过表达miR-940 可抑制肺癌细胞A549 和H226 迁移和侵袭的结果一致，提示miR-940 可作为肺癌治疗的潜在分子靶点。本研究还显示nazartinib 可促进NCI-H2170 细胞中miR-940 的表达，而敲减miR-940 降低了nazartinib 对NCI-H2170 细胞增殖和凋亡的影响，提示nazartinib 可能通过上调miR-940 表达来影响NCI-H2170细胞增殖和凋亡。

JAK2/STAT3是JAK/STAT通路中的一个重要信号通路，参与调控细胞的增殖和凋亡，与肺癌的发生发展密切相关［16］。STAT3 是STATs 家族成员之一，在多种肿瘤中异常活化，其异常活化导致细胞异常增殖分化，且凋亡受到抑制，是目前已被确认的癌基因［17］。STAT3 的致癌机制主要与其激活CyclinD1、Survivin等靶基因的产物表达有关。JAK2是STAT3 的上游分子，其特异性抑制剂AG490 可阻断JAK2/STAT3 信号通路，从而抑制细胞增殖［18］。研究显示，miR-19a 的下调可以抑制骨肉瘤SaOS-2细胞中的JAK2/STAT3 信号传导途径，促进Cleavedcaspase-3 和Bax 凋亡相关蛋白的表达，并增加细胞中的活性氧水平，从而促进SaOS-2 细胞凋亡并抑制其增殖［19］。本研究显示nazartinib 抑制了肺癌细胞NCI-H2170 中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白的表达，提示nazartinib 抑制了NCI-H2170 细胞中JAK2/STAT3 信号通路的激活；而敲减miR-940 则激活了NCIH2170细胞中JAK2/STAT3信号传导途径，进一步提示nazartinib 可能通过靶向上调miR-940 进而抑制JAK2/STAT3 信号传导途径来抑制NCI-H2170 细胞增殖及促进其凋亡。

综上，酪氨酸激酶小分子抑制剂nazartinib 可有效抑制肺癌细胞增殖，且促进细胞凋亡，其作用机制与靶向上调miR-940 表达并抑制JAK2/STAT3 信号传导途径有关。