翠竹鞭芽组培快繁高效再生技术体系的构建1)

郑毅 郑笑 林树燕 姚文静 徐薪璐 周必铙 卞丽丽

(南京林业大学，南京，210037)

翠竹(Pleioblastuspygmaeus(Miq.) E. G. Camus)为竹亚科大明竹属植物，植株矮小，耐阴，叶片翠绿，且极耐修剪，是一种十分优良的地被类观赏植物。尤其近年来，地被类竹种以及彩叶竹种在园林绿化中的应用愈来愈广泛，其经济价值近年来也逐渐飙高[1-2]。但受到繁殖材料的获得困难及繁殖方法的限制，传统的繁育方式已无法满足翠竹日益增大的市场需求，且园林用竹对植物的遗传构成一致性和植株大小的一致性要求较高；所以构建高效的翠竹组培快繁再生体系势在必行。

关于竹子的组织培养已取得了一些进展。自1982年起，国外相继报道了印度箣竹、勃氏甜龙竹等数十个竹种的组织培养技术研究情况[3]。我国对竹子组织培养技术研究起步较晚，但经几代科研工作者的不懈努力，目前麻竹[4-5]、甜龙竹[6]、巨龙竹[7]等重要经济竹种的组培快繁技术，在生产中的应用已经十分成熟。但实际生产中，利用试管快繁技术进行批量繁殖的园林观赏用竹并不多。由于竹类植物的花和种子不易稳定地获得，且除种胚外其余外植体类型都很难通过诱导愈伤分化获得再生植株[8]，所以以单芽为外植体，诱导产生芽丛，经诱导生根后移至土壤，这种不经过脱分化过程直接获得大量完整植株的繁殖方式应用更为广泛。

鞭芽是竹子出笋成竹、长鞭形成地下根系结构的基础。本研究以翠竹的鞭芽为试验材料，尝试构建翠竹组织培养快繁高效再生技术体系，为翠竹工厂化大规模生产和其园林应用推广提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2015年5月20日，将采于江苏省南京市南京林业大学白马基地竹种园(118°22′～119°14′E，31°14′～32°37′N)的翠竹(Pleioblastuspygmaeus(Miq.) E. G. Camus)种子播于花盆(上口内径26 cm、内高22 cm、盆底内径18 cm)中，培养基质选择体积比为V(泥炭)∶V(黄棕壤)∶V(珍珠岩)=12∶12∶1的混合基质；定期进行观察。2019年，将翠竹实生苗包括鞭根系统及基质整体取出，洗去泥土，选取翠竹竹鞭上带有未萌动和刚萌动鞭芽的鞭段(约1.5 cm)作为外植体。

1.2 外植体的消毒及启动培养

2019年5月，将盆栽实生苗取出，清水处理后，把竹鞭切分成1.5 cm长的带芽鞭段，用洗洁精清洗后，用自来水不间断冲洗24 h。随后在超净工作台上进行消毒处理，选取体积分数为70%的酒精、体积分数为2.5%的NaClO溶液两种消毒剂进行消毒。先用无菌水将鞭段冲洗3遍，之后在体积分数为70%的酒精中分别消毒处理30、60、90 s；用无菌水冲洗5遍后，再用体积分数为2.5%的NaClO溶液分别处理10、15、20 min。两种消毒剂各设3个处理水平，共9个处理组合，每个组合接种50瓶；处理时上下摇动，最后再用无菌水冲洗5遍，完成外植体的消毒。

本研究选择MS培养基为基本培养基，培养基中蔗糖质量浓度控制在30 g·L-1，pH控制在5.75～5.85之间。将消毒完毕的鞭芽，接种到诱导培养基“MS培养基+质量浓度为0.1 mg·L-1的噻苯隆(TDZ)+质量浓度为0.5 mg·L-1的萘乙酸(NAA)”上，每瓶1个；之后，将培养瓶置于无菌培养室中培养观察，每天12～14 h的光照，光照强度1 200～1 500 lx，培养室温度控制在25 ℃，试验重复3次；20 d后统计污染率及诱导成活率，污染率=(污染外植体数/接种外植体总数)×100%、成活率=(萌芽外植体数/接种后无菌茎段总数)×100%。

1.3 无菌翠竹鞭芽增殖培养

以鞭芽为外植体的瓶苗需要经增殖培养基的处理才能产生芽丛，待瓶苗诱导培养20 d，取成活且无菌的组培苗，将其接种在增殖培养基上。增殖培养的基本培养基仍选用MS培养基，生长调节剂则选用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA，质量浓度为3、4、5 mg·L-1)与萘乙酸(质量浓度为0.05、0.30、0.50 mg·L-1)，共9种处理，每个处理接种30瓶，每瓶接种1个无菌芽段。培养30 d观察增殖情况，统计每瓶内的丛芽增殖系数，增殖系数=扩繁后的芽数/转入的芽数。

1.4 翠竹丛芽的生根培养

将增殖后的芽苗继代培养3～5次，待丛芽增殖到20～30个时，将丛芽接种到生根培养基上。生根培养基选用0.5倍MS培养基作为基本培养基，以6-苄氨基腺嘌呤(质量浓度为0、0.5、1.0 mg·L-1)、萘乙酸(质量浓度为1.0、1.5 mg·L-1)、吲哚丁酸(IBA，质量浓度为0.5、1.0 mg·L-1)3种生长调节剂设置12个处理组合，每个组合接种30瓶。40 d后观察统计生根数、根长并计算生根率，生根率=(生根丛苗数/接入的总苗数)×100%。

1.5 翠竹瓶苗炼苗移栽

生根后，对翠竹瓶苗进行炼苗移栽。为保持瓶内湿度，塑料袋罩住去盖的培养瓶，将培养瓶揭盖置于培养室中炼苗15 d；取出组培苗，洗去培养基，移栽至基质中，定期浇水。设置3种培养基质，基质体积比分别为V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1、V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1、V(壤土)∶V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1∶1，每种基质栽种50株组培苗，观察植株生长情况并统计移栽成活率。

1.6 数据处理

采用SPSS22.0统计分析软件进行显著性分析及多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方案对污染率及成活率的影响

在洗洁精清洗、流水冲洗的基础上，本研究选用了体积分数为70%的酒精与体积分数为2.5%的NaClO溶液两种消毒剂搭配使用。

试验结果表明(见表1)：处理1的污染率最高，为94.00%；处理8、处理9的污染率最低，为4.67%、6.67%；说明体积分数为70%的酒精与体积分数为2.5%的NaClO溶液的消毒剂组合，可以有效地杀死大部分微生物，且随着处理时间的增长，污染率逐步降低。从外植体成活率看，对于酒精处理而言，处理90 s的平均成活率最低(为47.50%)，处理60 s的平均成活率最高(高达87.05%)；对于NaClO处理而言，处理20 min的平均成活率最低(为57.30%)，处理15 min的平均成活率最高(为69.15%)。这说明，虽然长时间处理的杀菌效果更好，但过长的消毒时间会导致芽段成活率较低，这与本研究的消毒目的相悖。这是由于鞭芽的芽组织十分幼嫩，酒精的过长时间处理影响了其生长活性，消灭微生物的同时也杀死了外植体材料。

表1 不同消毒方案的启动培养污染率及成活率

综合污染率、成活率两项指标看，最佳消毒方案为“体积分数为70%的酒精处理60 s+体积分数为2.5%的NaClO溶液处理15 min”，这样的组合，既有着不错的灭菌效果，且不会对芽的活性造成影响，有着较好的成活表现。

2.2 萘乙酸与6-苄氨基腺嘌呤对丛芽继代增殖的影响

不同组合的植物生长调节剂处理对芽丛增殖的效果不同(见表2)。由表2可见：对于6-苄氨基腺嘌呤而言，随着其质量浓度从3 mg·L-1提高到5 mg·L-1，增殖系数也从2.99提高到了5.91，芽丛长势也在逐渐提高。对萘乙酸而言，质量浓度为0.05 mg·L-1时，增殖系数最小，增殖效果也较差；质量浓度为0.30 mg·L-1时，增殖系数最高，芽丛增殖效果最好；质量浓度为0.50 mg·L-1时，芽段仍正常生长，芽丛长势也较好，但新生苗丛芽较少，增殖系数也相对较低。可见，随着细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤的质量浓度提高，芽丛的增殖效果越来越佳，6-苄氨基腺嘌呤质量浓度为5 mg·L-1时，增殖效果最好。而培养基中生长素萘乙酸的质量浓度过低时，芽丛的生长状况不佳，增殖效果也较差，随着萘乙酸质量浓度的提高，芽丛的长势逐渐变好，增殖系数也随之提高，但随着萘乙酸质量浓度的继续升高，芽苗高度越长越高，新生丛苗却没有随之增多。结果表明，当6-苄氨基腺嘌呤质量浓度为5 mg·L-1、萘乙酸质量浓度为0.3 mg·L-1时，翠竹芽段的增殖系数最高(为7.24)、新生芽丛数最多，且长势健壮、叶片宽大、颜色翠绿，增殖效果最好。

表2 不同植物生长调节剂配比时翠竹芽段的增殖状况

经邓肯(Duncan)多重比较，不同植物生长调节剂处理组合对芽段增殖系数的影响，不同处理组合之间表现不同：处理8为最高组；处理9低于处理8，而显著高于其他组，为次高组；处理1显著低于其他组，为最低组。说明不同植物生长调节剂配比对翠竹增殖的影响差异显著，处理8效果最好，处理1效果最差。综合效果，翠竹芽段最佳增殖培养基为“MS培养基+质量浓度为5 mg·L-1的6-苄氨基腺嘌呤+质量浓度为0.30 mg·L-1的萘乙酸”。

2.3 不同植物生长调节剂配比对翠竹生根的影响

在丛苗多次继代后进行生根诱导，生根培养培养基选用0.5倍MS培养基，设置12个不同的植物生长调节剂组合(见表3)，不同处理间生根率差异较大，处理4、处理6、处理11诱导生根效果较好，生根率分别达到了100%、85%、90%。

表3 不同植物生长调节剂配比处理的翠竹芽段生根率

2.3.1 翠竹生根诱导过程中的形态观察

以处理4为例，培养7 d时，开始有根出现(见图1a)；培养14 d时，根持续伸长，根数逐渐增多(见图1b)；培养35 d时，植株的根系已十分繁盛(见图1c)，生根数逐渐稳定，增长速度放缓；培养42 d时，植株的根继续伸长(见图1d)；培养49 d时，根系都已达到炼苗栽种要求(见图1e、f)。

2.3.2不同植物生长调节剂配比对翠竹生根数量的影响

以生根率较高的3个处理(处理4、处理6、处理11)为研究对象，对这3个处理中瓶苗的根，按生长长度(L)进行分级，具体分成010 cm的4个级别，分别统计每级内的根数及总根数，并计算每个时期的平均根长。每隔1周进行1次统计，共统计7次。

a为培养7 d时，翠竹组培苗不定根出现；b为培养14 d时，根进一步伸长；c为培养35 d时，根系逐渐增多；d为培养42 d时，根系继续伸长；e、f为培养49 d时，根系已经非常繁茂。

统计其平均生根数随时间的变化规律(见图2)。由图2可见：处理4生根最早，在0～7 d阶段已诱导出根，随后不断有新根产生；且在7～14 d阶段内根数增长速度较快，增幅较大；培养21 d后，其增长趋势逐渐平缓，每个阶段的增幅也较小。处理6生根最晚，在28～35 d阶段才有根生出，此阶段根数增长速度同样最快，7 d内有约30条新根产生。处理11生根也较晚，在21～28 d时才有根产生，此阶段也同样是处理11生根数增长速度最快的时期；在此之后，虽然其根数增长速度有所放缓，但每阶段都能保持5条以上的增幅；在49 d时，处理11的平均生根数为50.5条，超过了处理4的48.83条。综上所述，从诱导生根的速度看，处理4最早诱导出根，处理6、处理11则出根较晚。从诱导出根后根数的增长速度看，处理4在诱导出根后，经42 d根数才增长至46条左右，增长速度较为平缓；而处理11在出根后，仅用21 d根数便增长至相同水平，增长速度极快；处理6在相同时间21 d内，其根数也仅增长至42条；可见，处理11在诱导出根后，其平均生根数增长速度最快。

图2 3种处理的翠竹组培苗平均生根数

2.3.3不同植物生长调节剂配比对翠竹不同根长范围内平均生根数量及平均根长的影响

由表4可见：各个阶段内不同根长(L)级别的占比不同。处理4，010 cm的根出现。处理6、处理11，在生根后仅2周，2 cm10 cm的根数也在迅速增多。

移栽前进行的第7次统计结果表明，在对3种不同的植物生长调节剂组合处理进行诱导生根培养49 d后，处理4的平均生根数为48.83条，其中，010 cm的有1条(占2.40%)；处理6的平均生根数为41条，其中，010 cm的有1条(占3.66%)；处理11的平均生根数为50条，其中，010 cm的有3条(占7.64%)。结果表明，在同样培养49 d后，处理11中，2 cm10 cm级别的根数都高于其他处理组。

由表4可见：3种处理平均根长的变化，处理4的平均根长增长速度最慢；处理6的平均根长增长速度最快，但其根数相对较少；处理11的平均根长增长速度较快，其根数也足够多，且在49 d的生根培养过程中，处理11平均根长的峰值最高，可见其根系质量最好。

表4 3种植物生长调节剂组合施用时翠竹不同根长范围内的平均生根数量及根平均长度

由以上结果分析可得，处理11有着较高的生根率，其平均生根数的增长速度最快，平均根长的增长速度也较快，培养结束后，其平均根长也最长。综上所述，翠竹丛苗最佳生根培养基为“0.5倍的MS培养基+质量浓度为1 mg·L-1的6-苄氨基腺嘌呤+质量浓度为1.5 mg·L-1的萘乙酸+质量浓度为0.5 mg·L-1的吲哚丁酸”。

2.4 不同基质对移栽翠竹丛苗成活率的影响

炼苗后的翠竹丛苗移栽到3种基质中后，做好水分管理，每日喷水2次，2周后统计3种基质中丛苗的移栽成活率(见图3)。体积比为V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1的基质移栽成活率为100%，体积比为V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1的基质移栽成活率为85%，体积比为V(壤土)∶V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1∶1的基质移栽成活率为95%，说明将炼苗后的瓶苗移栽到体积比为V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1的基质中，成活效果最好。

a为无菌翠竹鞭芽萌发；b为丛芽诱导；c为丛芽增殖；d为生根培养；e为炼苗结束，移栽前的组培再生苗；f为盆栽组培苗。

3 结论与讨论

20世纪80年代，翠竹作为优质观赏竹种被引入南京林业大学竹种园。但由于竹子体内内生菌较多，组培污染率较高，其脱分化、再分化过程也较为困难，近30 a内仅有张春霞等[9]以翠竹幼竹茎段为外植体进行了组培快繁研究。目前仍无以翠竹鞭芽为外植体构建组培快繁体系的报道。

对于组培而言，无菌环境是其成功的关键，合适的外植体消毒方案十分重要。对于不同的外植体选取部位而言，其最适消毒方案间存在着较大差异。如王舒[10]认为，“体积分数为75%的酒精处理25 s+质量分数为0.1%的HgCl2溶液处理5.3 min”的消毒方案，对黄甜竹秆芽侧芽的消毒效果最好。王曙光等[11]将慈竹半木质化枝条用体积分数为70%的酒精擦拭1遍，质量分数为0.1%的升汞溶液消毒2次，每次12 min的效果最好。由于选用的外植体是带有节的地下鞭段，与其他植物和竹类其他取材部位相比，地下鞭芽节大且坚韧，鞭芽被坚实的箨片包被，一定程度上影响了消毒液的杀菌效果。本研究表明，对翠竹鞭芽用体积分数为70%的酒精浸泡处理60 s，再用体积分数为2.5%的NaClO溶液处理15 min的消毒效果最佳。在试验过程中还发现，翠竹鞭芽内生菌的潜伏期十分长，甚至在结束启动培养进行增殖培养时仍发现有新的内生菌污染的情况发生。

生长调节剂对植物组织培养而言意义重大，其种类的选择及浓度配比是调控组培苗生长的主要途径。本研究结果表明，在增殖培养阶段，翠竹鞭芽最佳增殖培养基为“MS培养基+质量浓度为5 mg·L-1的6-苄氨基腺嘌呤+质量浓度为0.30 mg·L-1的萘乙酸”，且发现在一定范围内，增殖系数随着6-苄氨基腺嘌呤质量浓度的增加而增大，适量的生长素萘乙酸有助于芽苗保持生长活性，促进增殖，但过高的萘乙酸质量浓度会使芽苗转向增高生长，减缓增殖新芽的速度，这说明高质量浓度的萘乙酸对苗高增高有益，但同时会抑制新芽产生。

芽丛诱导生根是竹类植物快繁体系构建中的难题，传统植物诱导生根只需进行生长素处理，但竹类植物不同，且不同竹种对生根培养基的要求差异巨大，需要通过改变植物生长调节剂的组合不断进行尝试。本研究表明，翠竹鞭芽丛苗最佳生根培养基为“0.5倍的MS培养基+质量浓度为1 mg·L-1的6-苄氨基腺嘌呤+质量浓度为1.5 mg·L-1的萘乙酸+质量浓度为0.5 mg·L-1的吲哚丁酸”。虽然配方“0.5倍的MS培养基+质量浓度为1.5 mg·L-1的萘乙酸+质量浓度为1 mg·L-1的吲哚丁酸”生根最早，生根率较高，但其在诱导出根后，新根的增长速度和伸长速度都没有前者高。这是因为早期在仅有萘乙酸、吲哚丁酸2种生长素的作用下，芽苗只进行生根活动，不进行芽苗的生长，所以出根最早。但在长期的生根培养过程中，芽苗本身出现了老化，上部生长的停滞使得生根速度也受到了一定影响。加入了细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤后，虽然早期需要进行一段时间的苗生长，但开始进行生根生长时，健壮的芽苗既可以稳定其本身的长势，也可以为生根活动提供一定的增益效果。王光萍等[12]研究表明，在诱导锦竹生根时，单一的生长素处理生根率较低，且很容易导致褐化，损伤植株，加入6-苄氨基腺嘌呤后该情况有所缓解。

前期翠竹的组培已有报道[9]，文中外植体材料采用的是翠竹茎段。而在本研究中考虑到翠竹的生物学特性，其竹鞭系统发达，材料充足，因而在本研究中改用鞭芽作为外植体材料，确保在外植体采集过程中不受到季节的限制。此外本研究详细研究了不同植物生长调节剂组合对翠竹组培苗生根的影响，优化了生根培养基配方。本研究对翠竹的再生体系进行了系统性的研究，可为后续其他竹种的再生体系建立提供参考。