高效液相色谱-串联质谱法测定食品接触材料及制品中33种初级芳香胺的迁移量

孟宪双，孙小杰，李 焘，白 桦，马 强

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.SCIEX亚太技术支持中心，北京 100015)

初级芳香胺(PAAs)是一类典型的化学危害物质，可通过皮肤、胃肠道和呼吸道进入人体，导致机体细胞DNA结构和功能的变化，从而对人体健康造成严重危害[1]。在制造过程中，食品接触材料及制品中聚合物材料使用的颜料[2]、纸张和纸板中使用的油墨[3]以杂质形式残留是PAAs的主要来源，食品接触塑料制品中的聚氨酯胶粘剂或油漆中的芳香族异氰酸酯水解，以及作为着色剂的偶氮染料也能降解生成PAAs。此外，在以聚酰胺制成的食品接触材料中也检出了PAAs[4-5]。其他聚合物、人造橡胶或添加剂等也可能含有PAAs残留[5]。因此，对于塑料类食品接触材料及制品，欧盟指令(EU)No 10/2011[6]规定了食品接触材料中残留的PAAs向食品中的迁移总量不得超过10 μg/kg。对于餐巾纸及其他由纸或纸板制成的食品接触材料，德国联邦风险评估研究所[3]规定：除上述欧盟要求的10 μg/kg限量外，被归为1A和1B类致癌物的PAAs在食品或食品模拟物中的检出量不得超过2 μg/kg。

目前，常用的食品接触材料中PAAs的检测方法包括气相色谱-质谱(GC-MS)[7]、毛细管电泳(CE)[8-9]、高效液相色谱(HPLC)[10-11]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[4,12-16]、液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)[17]等。研究人员基于上述分析技术，测定了层压软包装材料[7]、聚酰胺炊具[4]、塑料袋[11]及餐巾纸[18]等食品接触材料中PAAs的迁移量。但上述方法均采用单一的接触时间和接触温度，可能与实际应用中的迁移量存在偏差。同时，欧盟指令(EU)No 10/2011附件Ⅲ[6]规定了有关食品模拟物和塑料迁移测试的时间/温度条件。

基于此，本实验拟采用高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱复合质谱，建立食品接触材料及制品中33种初级芳香胺迁移量的分析方法。根据食品特性以及食品与食品接触材料的接触特点，分别设计迁移实验，使其更接近实际应用场景，有针对性地进行食品模拟物中PAAs总迁移量的测试。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪：美国Waters公司产品，配有二元泵、在线真空脱气机、自动进样器和柱温箱；QTRAP 6500三重四极杆-线性离子阱复合质谱仪：美国SCIEX公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)和Analyst数据处理软件；XS105分析天平：瑞士Mettler Toledo公司产品；CR21G高速冷冻离心机：日本Hitachi公司产品；0.22 μm有机微孔滤膜：天津津腾实验设备有限公司产品。

1.2 材料与试剂

33种初级芳香胺：纯度≥98%，分别购自美国Sigma-Aldrich公司、德国Dr. Ehrestorfer公司和美国Supelco公司；甲醇、甲酸(LC-MS级)，乙醇、乙酸(分析纯)：美国Thermo Fisher公司产品；超纯水：由Milli-Q50超纯水机制备，美国Millipore公司产品。

1.3 标准溶液的配制

分别称取10 mg(精确至0.1 mg)初级芳香胺标准品至10 mL棕色容量瓶，用90%甲醇水溶液溶解并定容，制得1 000 mg/L标准储备溶液，于-20 ℃避光保存。分别量取1 mL上述标准溶液至50 mL棕色容量瓶，用90%甲醇水溶液定容，制得20 mg/L混合标准溶液；然后用初始流动相将其稀释成适宜浓度的系列混合标准工作溶液，用于标准工作曲线的绘制。

1.4 迁移实验

依据欧盟指令(EU)No 10/2011的指导原则，本实验中亲水性、亲脂性及pH 4.5以下的食品分别采用20%乙醇、50%乙醇和3%乙酸溶液(V/V)作为食品模拟物浸泡液。对于一次性纸杯、具色塑料刀叉、食品袋、塑料奶瓶及奶嘴等食品接触材料，均制成边长为0.5～1.0 cm的矩形。称取5 g食品接触材料样品于容量瓶中，加入100 mL食品模拟物浸泡液，根据食品主要成分的理化特性以及预期是否重复接触食品，选择相应的食品模拟物浸泡液和迁移实验条件：1) 一次性纸杯等短期接触亲水性食品的，以20%乙醇溶液为浸泡液在40 ℃恒温浸泡2 h；2) 塑料奶瓶及奶嘴等长期重复接触亲水性食品的，以20%乙醇溶液为浸泡液在40 ℃恒温浸泡7天，进行3次迁移实验，每次使用新的食品模拟物浸泡液，迁移量以3次总和计；3) 具色塑料刀叉、食品袋等预期短期接触亲脂性食品的，以50%乙醇溶液为浸泡液在40 ℃恒温浸泡2 h；4) 预期长期接触亲脂性食品的，以50%乙醇溶液为浸泡液在40 ℃恒温浸泡7天；5) 预期短期接触酸性食品的，以3%乙酸溶液在100 ℃恒温浸泡2 h；6) 预期长期接触酸性食品的，以3%乙酸溶液在100 ℃恒温浸泡7天。取适量迁移溶液，在4 ℃下以10 000 r/min离心10 min，取上清液，供测试。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件 色谱柱：Phenomenex Kinetex F5柱(100 mm×3.0 mm×2.6 μm)；柱温40 ℃；流动相：0.05%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；梯度洗脱程序：0～3 min(30%～55%B)，3～7 min(55%～90%B)，7～9 min(90%B)，9.0～9.1 min(90%～30%B)，9.1～12 min(30%B)；流速0.3 mL/min；进样量5 μL。

1.5.2质谱条件 电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，毛细管温度550 ℃，喷雾电压1.2 kV，去簇电压45 V，载气为氮气，气帘气压力2.1×105Pa，碰撞气压力6.2×104Pa，鞘气压力4.5×105Pa，辅助加热气压力4.1×105Pa，数据采集模式为动态多反应监测(scheduled MRM)。33种初级芳香胺的保留时间、前体离子、碎片离子、碰撞能量等信息列于表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

由于初级芳香胺类化合物的苯胺母核结构带有伯胺基团，一般具有弱碱性，适宜采用ESI+模式检测。本实验考察了目标待测物在有机溶剂甲醇和乙腈中的质谱响应。结果表明，33种初级芳香胺在甲醇中的响应强度优于乙腈，推测可能由于甲醇具有一定的供质子能力，因此，后续优化实验采用甲醇作为流动相中的有机相。为获得良好的色谱峰形及较高的质谱响应，分别考察了0.01%、0.05%、0.1%甲酸水溶液、甲醇作为流动相时的情况。结果表明，绝大多数化合物在流动相为0.05%甲酸水溶液-甲醇时的色谱峰形最优，同时具有较高的质谱响应强度。因此，选择0.05%甲酸水溶液-甲醇作为流动相。

绝大多数初级芳香胺类化合物的极性较弱，本实验考察了Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)、Phenomenex Kinetex F5(100 mm×3.0 mm×2.6 μm)和Waters BEH Amide(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)3种适用于弱极性化合物色谱柱的分离结果。结果表明，绝大多数初级芳香胺类化合物在Phenomenex Kinetex F5色谱柱上的峰形相对最优，分离效果最佳，同时对同分异构体2,4-二甲基苯胺/2,6-二甲基苯胺、2,4-二氨基甲苯/2,6-二氨基甲苯、4-氨基联苯/邻氨基联苯、3-氯-4-甲氧基苯胺/4-氯-2-氨基苯甲醚实现了分离，示于图1。因此，选择Phenomenex Kinetex F5色谱柱作为33种初级芳香胺化合物的分离柱。

注：a.2，4-二甲基苯胺/2，6-二甲基苯胺；b.2，4-二氨基甲苯/2，6-二氨基甲苯；c.4-氨基联苯/邻氨基联苯；d.3-氯-4-甲氧基苯胺/4-氯-2-氨基苯甲醚图1 4对同分异构体的色谱图Fig.1 Chromatograms of four pairs of isomers

2.2 迁移实验条件优化

依据欧盟指令(EU)No 10/2011指导原则，按照食品的亲水性、亲脂性、pH值，以及食品接触材料及制品与食品是否重复接触、接触时间等特点，设计了6种迁移实验：将食品接触材料及制品分为短期接触亲水性食品类(如一次性纸杯)、长期且重复接触亲水性食品类(如塑料奶瓶)、预期短期接触亲脂性食品类(如具色塑料刀叉、食品袋等)、预期长期接触亲脂性食品类(如饼干、面包等食品的包装袋)、预期短期接触酸性食品类和长期接触酸性食品类(如塑料醋桶)。按照符合性测试中关于接触时间和接触温度的规定，分别设置了测试时间和测试温度，将不同场景下的迁移条件进行细分，可在最大程度上合理测定初级芳香胺的迁移量，获得准确的迁移量实验结果。

2.3 基质效应考察

采用电喷雾质谱分析样品，一般需要对基质效应(ME)进行考察。本研究考察了33种初级芳香胺的绝对基质效应(AME)，即在不考虑回收率的情况下，比较待测物在基质存在条件下和纯溶液条件下的质谱响应，将二者的比值定义为绝对基质效应，结果示于图2。当AME=1时，表示不存在基质效应；AME<1时，存在离子抑制效应；AME>1时，存在离子增强效应。本实验将不含待测物的空白样品按照迁移实验条件处理后，用迁移溶液配制与纯溶液中待测物相同浓度的试样，其中各待测物在20%乙醇和50%乙醇迁移溶液中的基质效应分别为86.1%～97.3%和88.7%～104.0%，总体在80%～120%之间，宜采用标准工作溶液进行定量；待测物在3%乙酸迁移溶液中的峰形较差，不利于定量，采用氨水调至pH 7.0时峰形明显改善，其基质效应在62.7%～81.3%之间。因此，采用空白样品的3%迁移溶液(pH 7.0)配制基质匹配标准工作曲线进行定量。

注：横坐标序号与表1序号一致图2 33种初级芳香胺的绝对基质效应Fig.2 Absolute matrix effects of the 33 PAAs

2.4 线性关系、检出限、定量限及重复性

本实验采用至少5个浓度水平的初级芳香胺溶液进行线性回归，以色谱峰面积为纵坐标(y)，待测物浓度为横坐标(x)进行加权最小二乘法回归计算，权重系数设为1/x2。33种初级芳香胺的线性相关系数、检出限、定量限及重复性结果列于表2。实验结果表明，33种初级芳香胺在各自的线性范围内线性关系良好，线性相关系数(r)介于0.990 4～0.999 5之间，检出限和定量限分别为0.02～1.04 μg/kg和0.07～3.26 μg/kg，能够满足欧盟指令(EU)No 10/2011中规定的10 μg/kg迁移量限值的检测要求。本实验考察了定量限浓度迁移溶液测试的重复性(n=5)，每隔2 h测定1次，20%乙醇、50%乙醇和3%乙酸(pH 7.0)迁移溶液中测定的初级芳香胺精密度分别为1.9%～9.5%、1.4%～7.5%和2.4%～8.8%，表明重复性较好，可满足实际测定需求。

表2 33种初级芳香胺的线性相关系数、检出限、定量限及重复性Table 2 Linear correlation coefficient, LOD, LOQ and repeatability of the 33 PAAs

续表2

2.5 实际样品迁移量测定

选择当地市场和网络商店销售的一次性纸杯、具色塑料餐具、食品包装袋、塑料奶瓶等样品，按照其所接触食品的性质、接触时间等特点进行针对性迁移实验。结果表明，在1例塑料刀叉样品的迁移溶液中检出邻甲苯胺、2,6-二氨基甲苯、4,4′-二氨基二苯甲烷和3,3′-二氯联苯胺，迁移量分别为0.80、1.56、0.62和3.11 μg/kg，总迁移量为6.09 μg/kg；在1例塑料包装食品袋中检出邻甲苯胺、邻氨基偶氮甲苯和2,4-二甲基苯胺，迁移量分别为0.81、0.76和0.42 μg/kg，总迁移量为1.99 μg/kg；均未超出欧盟指令(EU)No 10/2011规定的10 μg/kg迁移量限值。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱复合质谱法检测食品接触材料及制品中33种初级芳香胺的迁移量。根据食品特性以及食品与食品接触材料的接触特点分别设计了迁移实验。在优化的实验条件下，既可实现同分异构体的分离，又可满足实际检测的灵敏度。基质效应考察表明，3%乙酸迁移溶液中存在较明显的绝对基质效应，而20%乙醇和50%乙醇迁移溶液中的绝对基质效应不显著。本方法的线性关系、检出限、定量限、重复性、精密度等参数均符合实际检测要求，可用于实际食品接触材料及制品中33种初级芳香胺迁移量的测定。