系统性红斑狼疮患者外周血CD3+CD56+NKT水平与Th1/Th2细胞表达的相关性*

高娟 邢燕 张利军

(1.重庆市九龙坡区中医院检验科，重庆 400016；2.重庆医科大学附属第一医院输血科，重庆 400016；3.重庆医科大学附属第二医院检验科，重庆 400010)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)为常见慢性自身免疫性疾病，其发病机制复杂，迄今仍未完全明确。较多学者认为免疫功能紊乱贯穿于SLE的病理过程[1-2]。自然杀伤T(NKT)细胞为异质性T淋巴细胞，同时具有NK细胞与T淋巴细胞的部分特性[3]。CD3+CD56+淋巴细胞为NKT细胞中的一员，其参与了类风湿性关节炎[4]、Graves病[5]等自身免疫性疾病的发病与进展，而在SLE中的研究报道较少，且在SLE中的作用存在较大争议。本研究选取112例SLE患者，采用流式细胞仪测定CD3+CD56+NKT细胞的表达情况，旨在探讨外周血CD3+CD56+NKT细胞表达与相关机制的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年8月～2020年12月重庆市九龙坡区中医院收治的112例SLE患者为SLE组。纳入标准：①符合美国风湿病学会制定的SLE诊断标准[6]。②近半年内未接受过免疫抑制剂、类固醇激素治疗。③未合并其它自身免疫系统疾病。④自愿参与本研究且对研究内容充分知情。排除标准：①合并急慢性感染、严重肝肾功能不全及恶性肿瘤者。②非SLE所致精神病。③妊娠期和哺乳期妇女。另选取同期我院体检科健康自愿者50例为健康组。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器 流式细胞仪(美国BD公司，FACScalibur型)，酶标仪(美国BIO-RAD公司，3550UV型)，小鼠抗人单克隆抗体CD3FITC、CD56-PE均由美国BD公司生产，二抗均购自美天旎生物科技公司，IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10酶联免疫法(ELISA)试剂盒购自美国R&D公司，淋巴细胞分离液由加拿大Norgen Biotek生产，乙二胺四乙酸(EDTA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)缓冲液由北京索莱宝科技有限公司生产，试验操作均按试剂说明书执行。

1.2.2 外周血CD3+CD56+NKT测定 采集受试者空腹静脉血3 mL，EDTA抗凝，取5μL加入流式管，加入单抗CD3FITC、CD56-PE，室温避光孵育 20 min，再经PBS缓冲液洗涤2次，1200 r/min 离心(离心半径：10 cm)10 min后收集细胞，上流式细胞仪检测，使用 Cellquest 软件获取并进行数据分析。

1.2.3 外周血相关细胞因子测定 取上述血液2 mL，2000 r/min离心(离心半径：10 cm)10 min后取血清层，采用酶联免疫法测定血清中IFN-γ、IL-4浓度，并在酶标仪450 nm处测定吸光度值，通过绘制标准曲线计算出相应指标的浓度。

1.2.4 资料收集 收集患者SLE疾病活动指数(SLEDAI)评分、24 h尿蛋白定量(24 hUPQ)等其他临床参数。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 SLE组：男34例，女78例；年龄21～63岁，平均(28.41±6.37)岁；体质量指数21～25 kg/m2，平均(23.05±3.28)kg/m2；病程0.5～15年，平均(5.37±1.20)年，按SLEDAI[7]评分分为非活动期(SLEDAI<5分)72例，活动期(SLEDAI≥5分)40例。健康组：男16例，女34例；年龄20～62岁，平均(28.26±6.51)岁；体质量指数21～24 kg/m2，平均(23.12±3.31)kg/m2。两组受试对象上述临床资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 两组CD3+CD56+NKT细胞水平比较 SLE组外周血CD3+CD56+NKT细胞计数及占比均较健康组明显减小，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 健康组与SLE组外周血CD3+CD56+NKT细胞水平比较

2.3 SLE不同疾病活动度CD3+CD56+NKT细胞水平及其他参数比较 SLE活动期组CD3+CD56+NKT细胞水平及其占比、IFN-γ、IFN-γ/IL-4均明显低于非活动期组(P<0.05)，而SLEDAI评分、24 hUPQ、IL-4明显高于非活动期组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同疾病活动度SLE患者CD3+CD56+NKT细胞水平及其他参数比较

2.4 CD3+CD56+NKT与SLE临床参数的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，CD3+CD56+NKT细胞与SLE患者SLEDAI评分、24hUPQ及IL-4呈负相关(r=-0.573、-0.682、-0.374，P<0.05)，而与IFN-γ无显著相关性(r=0.016，P>0.05)，见表3。

表3 CD3+CD56+NKT与SLE临床参数的相关性分析

3 讨论

SLE是一种好发于青壮年的自身免疫性疾病，我国SLE年新发约70～100/10万例，呈逐年增长趋势，其中女性患病率约为男性的10倍[8-10]。免疫系统紊乱为SLE的重要病理机制，病情未得到控制常累及血液、关节、皮肤等多器官系统，严重危害机体健康。目前SLE的诊断主要依据临床症状、自身抗体指标、免疫学指标及影像学检查等，但易与类风湿关节炎、系统性血管炎等病症混淆，造成漏诊或误诊[11-13]。随着近年来对SLE免疫机制研究的不断深入，学者发现NKT细胞与SLE的发病关系密切，有望成为SLE诊断和病情严重程度评估的新指标[14-15]。

本研究结果显示，SLE组外周血CD3+CD56+NKT细胞计数及占比均明显小于健康组，且SLE活动期CD3+CD56+NKT细胞水平及其占比明显低于非活动期组，同时Pearson相关分析发现，CD3+CD56+NKT细胞与SLE患者SLEDAI评分呈显著负相关，提示CD3+CD56+NKT细胞参与了SLE的发病过程，SLE患者机体存在外周血CD3+CD56+NKT细胞数量及占比降低，且活动期其表达水平更低，与王锡携[16]报道结果一致。NKT细胞广泛分布在胸腺、骨髓及肝脏等多个组织器官中，在外周血中的水平较低，其可同时表达T细胞的表明标志(CD3、T细胞受体等)和NK细胞的表明标志(CD16、CD56等)，兼有T细胞与NK细胞的生物功能，并可连接固有免疫与适应性免疫，参与机体免疫应答过程，调节自身防御网络[17-19]。邹原方等[20-21]研究发现，SLE患者存在CD3+CD56+NKT细胞数量减少和细胞功能缺陷，并认为其原因可能与机体分泌干扰素诱导NKT细胞凋亡有关。本研究分析认为，SLE活动期患者机体存在的大量抗体与免疫复合物可能诱导NK细胞减少和NK细胞功能抑制，导致SLE患者适应性免疫与固有免疫调节失衡，造成机体免疫系统紊乱；同时，CD3+CD56+NKT细胞可能在杀伤靶细胞作用时与其功能凋亡，在SLE进展过程中，CD3+CD56+NKT细胞数量较少，SLEDAI增加，病情越重，免疫紊乱程度愈加严重。值得注意的是， SLE活动期24 h尿蛋白定量高于非活动期，CD3+CD56+NKT细胞与SLE患者24 hUPQ呈负相关，表明SLE活动期肾功能损害更严重，CD3+CD56+NKT细胞可能成为SLE早期肾损伤的诊断标志物，有待进一步探讨。

Th1 /Th2细胞平衡向Th2细胞漂移是SLE发病重要病理机制[22]，在NKT细胞发挥免疫过程中可分泌IL-4促进Th2细胞功能增强，使SLE活动度增加[23]。并有研究证实[24-25]，CD3+CD56+NKT细胞可通过分泌IL-2、IL-6、IL-10等相关因子参与Th0转化为Th1/Th2细胞的过程。本次研究中测定的外周血IFN-γ、IL-4，其分别由Th1细胞、Th2细胞分泌，SLE活动期IFN-γ、IFN-γ/IL-4均明显低于非活动期组，而IL-4明显高于非活动期组，且Pearson相关分析结果显示，CD3+CD56+NKT细胞与SLE患者IL-4均呈显著负相关，而与IFN-γ无显著相关性，提示CD3+CD56+NKT细胞可能参与了Th1/Th2平衡调节。原因分析，CD3+CD56+NKT细胞受刺激活化后，通过分泌IL-4等细胞因子，引发Th2型免疫反应，Th2细胞功能亢进并释放特异性细胞因子的功能，抑制T细胞成熟和分化，导致机体免疫调节机制破坏，自身反应细胞过表达，出现自身免疫反应损伤，加重病情。

4 结论

CD3+CD56+NKT细胞参与了SLE免疫调节过程，其水平与患者SLEDAI评分呈显著负相关，CD3+CD56+NKT细胞可能通过分泌Th1/Th2细胞相关因子发挥SLE免疫调节作用，值得临床借鉴。