高良姜素通过巨噬细胞极化及抑制锌指蛋白 Zbed3诱导大鼠肝癌细胞凋亡的研究*

胡春兰 周龙 田玲 邓利艳

(1.重庆大学附属三峡医院全科医学科，重庆 500101；2.重庆大学附属三峡医院医学检验科，重庆 500101；3.重庆万州区人民医院重症医学科，重庆 404100)

诱发肝癌产生的因素较多，目前尚未完全掌握，但生活中一些因素会增加肝癌的发病率，如肝炎病毒、进食含有黄曲霉毒素的食物、酗酒等[1]。肝癌早期无特异性特征，随着病情的发展，患者会产生食欲不振、腹痛腹胀、消瘦等。常见的并发症为恶心、意识不清、便秘、晕厥、胆固醇水平升高等[2]。寻找安全有效、靶点明确、低毒的天然抗肿瘤药物是科学界研究的焦点，从中药中筛选有效的活性物质治疗肝癌是中药发展的中药渠道。高良姜素是天然的黄酮醇类化合物，可从植物高良姜植株的地上部分及根茎和蜂胶中提取得到。研究发现[3]，高良姜素具有镇痛、止呕、抗氧化以及抗肿瘤作用，高良姜素可抑制皮肤癌、骨瘤等癌细胞的增殖、转移并诱导肺癌细胞凋亡。肿瘤微环境与肿瘤的产生与发展联系密切，巨噬细胞在肿瘤微环境中较为重要。肿瘤为逃避巨噬细胞的杀伤作用，迫使其极化状态发生改变，以促进肿瘤发生发展。巨噬细胞极化有两种类型：M1型(杀伤肿瘤)与M2型(促进肿瘤)。可看出，巨噬细胞极化对肿瘤治疗至关重要。涉及巨噬细胞极化的机制也有很多，包括信号转导通路等。Wnt信号通路的异常与癌细胞生物学行为密切相关，该通路主要由Axin、GSK3β、β-catenin等组成，目前已有多项研究表明该通路中的相关因子(Axin、β-catenin等)在肝癌的转移、凋亡中具有重要作用[4]。但影响该通路中因子活性的因素较为复杂，目前尚未完全明确。近年来，相关报道表明[5]，Zbed3(锌指蛋白3)可与wnt号通路中的Axin结合，通过抑制Axin-GSK3β复合体功能，阻滞β-catenin降解，激活Wnt/β-catenin通路，促进细胞增殖。目前，关于Zbed3对人类肿瘤的相关文献较少，因此本研究探讨高良姜素诱导巨噬细胞极化对肝癌大鼠瘤体体积及锌指蛋白Zbed3的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及瘤株 健康SD雄性大鼠74只，鼠龄6～8周，体质量250～300 g，常规饲养，自由饮食饮水，购自杭州固拓生物公司。合格证号：SCXK(浙)2019-0024。Walker-256瘤株购自无锡欣润生物公司。本研究经重庆大学附属三峡医院伦理委员会审批(批号：Y2018-009-12)。

1.2 药品及配制 高良姜素购自上海莼试生物公司，在使用时将高良姜素溶解于含5%吐温80的生理盐水中，并稀释成实验所需浓度。

1.3 实验试剂 Zbed3一抗(上海谷研公司)；GSK3β、Axin一抗(武汉菲恩公司)；β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(贵州平生公司)；辣根过氧化物酶二抗(湖北猫尔沃公司)；TUNEL工作液(苏州宇恒公司)；戊巴比妥钠(湖北鸿运隆公司)。

1.4 模型建立及分组 取4只大鼠，将Walker-256瘤株常规复苏、培养扩增、腹水传代，将含肿瘤细胞的腹腔液注射到皮下种植幼鼠的腋下或腹股沟皮下，每个注射点用0.3～0.5 mL共注射15处。7 d后处死全部皮下种植鼠，手术切除皮下种植瘤块，挑选出鱼肉状组织，并切成2 mm3大小若干块。置于生理盐水中备用，在2～3 h内移植完。 取56只SD大鼠，麻醉后仰位固定，手术区用75%乙醇消毒。在腹正中皮肤切开5～10 mm用显微组织镊子将肝包膜捅一小口，将肿瘤块沿隧道嵌入。移植完毕后检查无渗血逐层缝合腹壁[6]。 移植成功1 W后，将未处理的14只健康大鼠作为对照组，常规饲养；56只模型大鼠意外死亡1只，建模失败3只，剩余52只大鼠随机分为模型组(模型大鼠常规饲养)、高良姜素低剂量组(模型+25 mg/kg/d高良姜素灌胃)、高良姜素中剂量组(模型+50 mg/kg/d高良姜素灌胃)及高良姜素高剂量组(模型+100 mg/kg/d高良姜素灌胃)，每组13只，各组开始治疗时间为移植1周后；治疗时间为 28 d，即移植后 35 d。

1.5 检测指标

1.5.1 HE染色观察各组大鼠病理形态 取各组大鼠戊巴比妥钠麻醉后处死，取出肝脏组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规制作切片，并进行HE染色，最后以中性树胶封片，在偏光显微镜下观察大鼠肝脏组织中的病理改变。

1.5.2 TUNEL检测肝癌细胞凋亡 取各组大鼠肝癌组织石蜡切片脱蜡，加入20 μg/mL不含核酸内切酶的蛋白酶K，常温孵育15～30 min，PBS洗涤后加入TUNEL检测液，常温无光孵育1 h，PBS清洗，加50 μLconvertr-POD，常温无光孵育0.5 h。PBS清洗，DAB液显色，冲洗，苏木素复染，脱水透明，封片。荧光显微镜下观察，并计数其中发荧光的阳性细胞。凋亡率:凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5.3 各组大鼠瘤体体积检测 治疗结束后，取各组大鼠麻醉后处死，剖腹、暴露肝脏，在手术显微镜下用游标卡尺测定肿瘤最大长径(a)和最短径(b)。

1.5.4 免疫组化检测肿瘤巨噬细胞中CD11c(M1型巨噬细胞标志蛋白)、CD206(M2型巨噬细胞标志蛋白)表达 采用免疫组化SP法检测肿瘤相关巨噬细胞标志物(CD11c、CD206)的表达。制作2 μm厚度的肝癌石蜡组织连续切片，二甲苯脱蜡并在梯度乙醇中进行水化，之后将组织切片置于 EDTA抗原修复溶液中进行高压抗原修复，将切片在3%过氧化氢中孵育20 min阻断内源过氧化物酶活性。孵育一抗，即添加兔抗人多克隆抗体CD206、CD11c(1∶100)。然后4℃下孵育过夜， 用PBS溶液冲洗后加入通用型二抗在37℃下孵育30 min。PBS洗片后，进行DAB显色。终止显色后，苏木精复染、梯度乙醇脱水、透明、封片及镜下观察。免疫组化结果的判定由两名临床经验丰富的病理科医师双盲下完成。随机选择切片组织上5个不重复视野进行免疫组化评分，评分包括染色强度和阳性细胞百分比，染色强度定义如下:棕褐色:3分、棕黄色:2分、淡黄色:1分、着色弱或不着色:0分，阳性细胞百分比即染色细胞占视野内全部细胞的百分比评分。定义如下:≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分； >75%为4分。 切片最终评分=着色细胞强度评分×阳性细胞百分比评分。最终评分0分记为阴性；1～3分记为弱阳性；4～6分记为中等强度阳性；400倍镜下选取5处代表性区域，评估其阳性细胞百分比，取平均值，最后大于平均值即定义为高表达，小于平均值定义为低表达。

1.5.5 Wbstern Blot检测Zbed3与Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平 取各组大鼠肝组织，蛋白裂解液裂解，匀浆机匀浆，离心后收集上清。测定蛋白浓度。将组织裂解产物进行电泳，硝酸纤维素膜转印，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Zbed3、GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(1∶500)，后加入辣根过氧化物酶二抗(1∶1200)，杂交冲洗。后将膜浸入ECL工作液，随后进行检测，获取图象。蛋白含量通过增强化学发光试剂盒检测并取其与B-actin的比值作为蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 HE染色结果 对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列有序，形态正常；模型组大鼠瘤组织呈膨胀性生长，癌细胞大小不一，肝细胞索挤压，排列不齐，并可见纤维素样结构；高良姜素低、中、高剂量组大鼠均出现肿瘤细胞间隙增宽，肿瘤细胞出现不同程度的肿胀变性，呈现泡沫状改变，肿瘤细胞巢可见大量炎细胞浸润，各组均可见不同程度的肿瘤细胞坏死灶。见图1。

图1 HE染色结果(400×)

2.2 肝癌细胞凋亡检测结果 对照组大鼠无肝癌细胞；模型组细胞凋亡率(21.32±2.14)%低于高良姜素低剂量组(29.45±3.28)%，差异有统计学意义(t=5.085，P<0.05)；高良姜素低剂量组细胞凋亡率低于高良姜素中剂量组(36.41±3.17)%，差异有统计学意义(t=3.737，P<0.05)；高良姜素中剂量组细胞凋亡率低于高良姜素高剂量组(47.25±5.31)%，差异有统计学意义(t=4.294，P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠肝癌细胞凋亡结果(400×)

2.3 各组大鼠瘤体体积检测结果 对照组大鼠无瘤体，模型组瘤体体积(124.35±13.47)mm3高于高良姜素低剂量组(95.26±8.47)mm3，差异有统计学意义(t=6.841，P<0.001)；高良姜素低剂量组瘤体体积高于高良姜素中剂量组(67.28±5.32)mm3，差异有统计学意义(t=10.470，P<0.001)；高良姜素中剂量组瘤体体积高于高良姜素高剂量组(54.71±5.14)mm3，差异有统计学意义(t=8.838，P<0.001)。见图3。

图3 各组大鼠瘤体体积对比

2.4 CD11c、CD206检测结果 与对照组相比，模型组大鼠肝癌组织中CD11c阳性率降低、CD206升高(均P<0.05)。与模型组相比，高良姜素低剂量组CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。与高良姜素低剂量组相比，高良姜素中剂量组CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。与高良姜素中剂量组相比，高良姜素高剂量组CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。见表1、图4。

表1 各组大鼠CD11c、CD206水平对比

2.5 Zbed3与Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平检测结果 与对照组相比，模型组大鼠肝组织中GSK3β、Axin水平降低，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平升高(均P<0.05)。与模型组相比，高良姜素低剂量组GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。与高良姜素低剂量组相比，高良姜素中剂量组GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。与高良姜素中剂量组相比，高良姜素高剂量组GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。见表2、图5。

图4 CD11c、CD206水平对比

表2 各组下列指标水平对比

图5 各组蛋白水平比较

3 讨论

肝癌是我国最常见的肿瘤之一，根据国家癌症中心发布的数据，2018年预估新发病例近50万人，死亡人数43万，发病后死亡比例较高[7]。本研究运用高良姜素治疗肝癌大鼠，探讨对巨噬细胞极化以及瘤体体积、锌指蛋白Zbed3的影响。

近年来，炎症在肿瘤中扮演越来越重要的角色，肿瘤免疫微环境在肿瘤发生发展中的作用成为近些年来肿瘤研究的热点。巨噬细胞在肿瘤细胞中至关重要，包含两个表型，M1型巨噬细胞可抑制癌细胞增殖并促进其凋亡、提高机体免疫能力，M2 型可以分泌细胞因子转化生长因子-β，白介素1β等降低机体的免疫功能促进肿瘤的生长，直接或间接地促进血管生成和肿瘤转移[8-9]。研究发现在胶质瘤[10]、胰腺癌[11]等恶性肿瘤中，M2型巨噬细胞提示患者预后不良。高良姜素具有镇痛、抗氧化，抗肿瘤等作用，且已有研究证实其在肝癌[12]、肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]等肿瘤中均可促进细胞凋亡。本文研究发现，在肝癌中，M1型巨噬细胞标志蛋白CD11c表达低于健康大鼠，M2型巨噬细胞标志蛋白CD206表达高于健康大鼠，且呈现出明显的剂量依赖性。且本文TUNEL检测结果提示，在经过高良姜素干预后，癌细胞凋亡增加。TUNEL的原理是利用细胞的凋亡使在细胞内外各种诱导凋亡因素的作用下，经一系列胞内信号转导系统激活内源性核酸内切酶，该酶切开 DNA 而形成 180-200bp 或其整倍数的寡核苷酸片段，暴露出的 3'羟基在末端转移酶(TDT)的作用下与生物素标记的核苷酸结合，最终借助抗生物素抗体结合的过氧化物酶，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。谢昌利等[16]在对肝癌的实验中提出，M1型巨噬细胞可促进癌细胞的凋亡，在经过干扰IRF1后，促进了M1型巨噬细胞向M2型转化，促进了癌细胞的增殖。在石旭等[17]对肝癌的实验中提出，高表达的 hnRNP L可促进M2型巨噬细胞标志蛋白CD206的表达，从而促进肝癌发展。汪俊剑等[18]在对肺癌细胞的研究中提出，高良姜素可通过阻滞细胞周期进程,降低线粒体膜电位,打破细胞内钙离子稳态来诱导肺癌细胞凋亡。本研究与上述研究结果相似，因此本文推测，高良姜素可能是通过提高CD11c表达，促进巨噬细胞向M1型转化，通过抑制CD206表达，阻滞巨噬细胞向M2型转化，从而促进癌细胞凋亡，抑制增殖。且本文中HE染色结果也表明在经过高良姜素干预后肿瘤细胞出现病死灶。

相关研究表明[19]，Zbed3在肺癌中高表达，并与肿瘤淋巴结转移相关，影响患者的预后，提示其可能是维持肺癌恶性表型的分子，可能成为临床治疗靶点。Wnt信号通路的异常与肿瘤产生、发展密切相关。目前，已有研究证实[20]，Zbed3可通过抑制小鼠胚胎成纤维细胞中的Axin-GSK3β复合体功能，阻滞β-catenin降解，使得Wnt通路激活后促进细胞增殖。另有研究发现[21]，抑制Zbed3水平后，肺癌细胞的增殖、侵袭能力下降，提示其参与肿瘤的预后。在肺癌中，降低Zbed3水平后β-catenin、c-myc、cyclin-D1表达降低，提示可能是癌细胞增殖能力下降的原因。相关研究提出[22]，Zbed3可能为调节Wnt通路中关键分子β-catenin及下游靶基因的重要分子，从而影响癌细胞的增殖及侵袭，促进肺癌的恶性表型及患者预后。近年来，多项研究表明，高良姜素通过调控Wnt/β-catenin通路可调控癌细胞的生物学行为[23]。在李永峰等[24]对乳腺癌细胞的研究中提出，高良姜素通过调控Wnt/β-catenin通路，促进乳腺癌细胞凋亡。经本文研究发现，与肝癌大鼠相比，在经过高良姜素干预后，GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低，且呈现出剂量依赖性。范垂锋[25]在对肺癌的研究中提出，抑制Zbed3表达后，通过促进Axin-GSK313复合体的功能后，降低了β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平，从而抑制了肺癌细胞的增殖并促进了凋亡。刘明江等[26]在研究中提出，通过提高GSK3β水平后可激活Wnt/β-catenin信号通路，促进巨噬细胞向M1型分化，从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡。本文研究结果与上述研究结果相似，因此本文认为，高良姜素可能是通过调控Wnt/β-catenin通路，从而促使了巨噬细胞向M1型转化，促进癌细胞凋亡，降低了Zbed3的表达。且本文瘤体体积检测结果也表明在经过高良姜素的治疗后，体积减小。

4 结论

高良姜素通过调控Wnt/β-catenin通路，促进巨噬细胞向M1型转化并抑制其向M2型转化，降低了Zbed3水平从而促进癌细胞凋亡并减小瘤体体积。