猪群免疫应激及运输应激检测指标的筛选

崔亮亮，苏娜瑛，陈永林，吕志凯，孙秀秀，王璐梦，刘晓丽，张万坡，胡薛英，谷长勤，程国富 (华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070)

我国一直以来都是猪肉消费大国，近年来生猪养殖规模不断扩大，但由于应激对猪的福利和生产性能产生不良影响，集约化养猪场的应激问题日益引起人们的关注。由各种应激原(免疫、运输、高温、低温、微生物感染等)引起的应激使机体发生代谢紊乱，甚至出现损伤及死亡，造成了巨大的经济损失。随着动物福利的普及和养殖水平的提高，生产过程中所面临的应激原也越来越少。但是，异地育肥的养殖模式导致猪在生产过程中至少被运输1次，接种的疫苗种类与次数更是繁多，使运输应激和免疫应激仍是现代养殖中不可避免的问题，对养殖生产造成了很大的负面影响。在应激反应中，机体的神经-内分泌系统激活，同时免疫系统也被激活。细胞因子可作为一种介质调节神经-内分泌系统与免疫系统之间的复杂网络，使机体能够在一定限度内维持平衡[1]。其中，IL-1β、IL-6、TNF-α 3种促炎细胞因子在应激领域中的研究最多[2-4]。急性期反应是机体的一种非特异性反应，合成的急性期蛋白对机体有广泛防御意义(杀死感染微生物、修复受损组织、恢复机体平衡等)[5]。正常情况下，机体血液中的急性期蛋白浓度很低，而在应激原的刺激下，浓度会发生显著改变，这就使得急性期蛋白易于检测。在应激反应中，研究最多的有CRP、HP、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP等。因此，本试验以现代猪场中最常见的运输应激与免疫应激为研究对象，研究了应激时细胞因子与急性期蛋白的变化规律，期望能够找到合适的指标用来检测猪的应激。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验动物 35日龄左右的二元杂交(大白×长白)仔猪购自广西贵港市某规模化猪场。

1.1.2主要仪器 核酸/蛋白质浓度测定仪(型号：DU-640)购于美国Beckman公司；高速冷冻离心机(型号：5424R)购于德国EPPENDORF公司；荧光定量PCR仪(型号：Step One Plus)购于美国ABI公司；酶标仪(型号：MK3)购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3主要试剂 猪圆环病毒2型灭活疫苗(WH株)购于武汉科前生物股份有限公司；RNA isolater(商品号：R401-01)购于南京诺唯赞生物科技有限公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(商品号：R223-01)购于南京诺唯赞生物科技有限公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(商品号：Q711-02)购于南京诺唯赞生物科技有限公司；Pig IL-6 ELISA Kit(商品号：CSB-E06786p)购于武汉华美生物工程有限公司；Pig SAA ELISA Kit(商品号：CSB-E13309p)购于武汉华美生物工程有限公司；Pig Apo-A1 ELISA Kit(商品号：CSB-E06834p)购于武汉华美生物工程有限公司；Pig-MAP ELISA Kit(商品号：CSB-E13425p)购于武汉华美生物工程有限公司；Pig AGP ELISA Kit购于南京建成生物工程研究所。

1.1.4引物设计及合成 从NCBI数据库网站中获取β-actin、CRP、HP、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP序列并设计引物，引物序列见表1，由武汉生工生物工程公司合成。

表1 荧光定量PCR引物相关信息

1.2 方法

1.2.1试验动物分组及处理 将仔猪分为3组，分别为对照组(3头)、免疫应激组(4头)、运输应激组(4头)。首先从健康猪群中随机选择7头仔猪作为对照组和运输应激组。随后给栏内剩余仔猪注射2 mL 猪圆环病毒2型灭活疫苗(WH株)，部分仔猪迅速出现了明显的应激症状(呼吸急促、皮肤发红、惊厥等)，从中随机选取4头作为免疫应激组，4 h 内剖杀；运输应激组仔猪参照文献[6]，采用敞篷车模拟公路运输4 h后剖杀，时速约为30 km/h，环境温度约为12℃；对照组不做任何处理，直接剖杀。剖检前用灭菌离心管采集猪血液备用，剖杀后迅速采集肝组织样品液氮速冻后保存于-80℃保存。

1.2.2肝组织RNA提取、cDNA合成、荧光定量PCR检测 使用TRIzol法提取肝组织总RNA，应用反转录试剂盒分两步进行反转录，第1步加入4× gDNA wiper Mix 4 μL， Total RNA 1 μg，加RNase Free H2O补齐至16 μL，42℃水浴2 min。第2步在第1步的反应液中加入5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡ4 μL，混匀后置于PCR仪，50℃反应15 min，85℃反应5 s，获得cDNA，将cDNA置于-20℃ 保存。荧光定量PCR采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光染料法进行，反应体系：2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。避光混合反应体系，短暂离心后将样品置于Applied Biosystems StepOnePlus实时荧光定量PCR仪中进行反应。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s和72℃延伸1 min，共40个循环。

1.2.3血清分离及酶联免疫吸附测定 待血液常温凝固2 h后于3 000 r/min室温离心15 min，取上清，分装后保存于-80℃ ，用于后续酶联免疫吸附测定。采用双抗夹心酶联免疫法测定IL-6；采用酶联免疫竞争法测定SAA、Apo-A1、AGP、pig-MAP，具体试验时严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 运输应激组肝组织细胞因子与急性期蛋白转录水平变化利用qPCR技术检测运输应激组肝组织细胞因子与急性期蛋白转录水平变化。结果如图1所示，与对照组相比，运输应激组肝组织IL-6表达量显著下降(P<0.05)；IL-1β、TNF-α相对表达量无显著性改变；CRP、HP、SAA、pig-MAP表达量显著上升(P<0.05)，其中CRP、SAA、pig-MAP表达量的增加极显著(P<0.01)；AGP相对表达量无显著性改变；Apo-A1相对表达量极显著下降(P<0.01)。

图1 运输应激组仔猪肝组织细胞因子与急性期蛋白转录水平分析

2.2 运输应激组血清中细胞因子与急性期蛋白含量变化通过ELISA技术检测运输应激组血清中IL-6、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP含量。结果如图2所示，同对照组相比，运输应激组血清中IL-6含量极显著降低(P<0.01)；SAA、pig-MAP含量显著升高(P<0.05)，其中pig-MAP含量的极显著升高(P<0.01)；Apo-A1浓度显著降低(P<0.05)；AGP浓度无显著性变化。

图2 运输应激组血清中细胞因子与急性期蛋白的浓度测定

2.3 免疫应激组肝组织细胞因子与急性期蛋白转录水平变化利用qPCR技术检测免疫应激组肝组织细胞因子与急性期蛋白转录水平变化。结果如图3所示，与对照组相比，免疫应激组肝组织IL-1β表达量极显著增加(P<0.01)；IL-6相对表达量极显著增加(P<0.01)；TNF-α相对表达量无显著性差异；CRP、HP、SAA、AGP表达量无显著性改变；Apo-A1相对表达量极显著下降(P<0.01)；pig-MAP相对表达量显著增加(P<0.05)。

图3 免疫应激组仔猪肝组织细胞因子与急性期蛋白mRNA的表达分析

2.4 免疫应激组血清中细胞因子与急性期蛋白浓度变化通过ELISA检测免疫应激组血清中IL-6、SAA、AGP、Apo-A1、pig-MAP浓度。结果如图4所示，免疫应激组血清中IL-6浓度极显著高于对照组(P<0.01)；pig-MAP浓度显著高于对照组(P<0.05)；Apo-A1极显著低于对照组(P<0.01)；SAA、AGP浓度与对照组无显著性差异。

图4 免疫应激组血清中细胞因子与急性期蛋白的浓度测定

3 讨论

本试验以最常见的免疫应激与运输应激为对象，检测了在应激中研究最多的3种细胞因子。IL-1β、IL-6、TNF-α由单核细胞、巨噬细胞等细胞合成并分泌，可激发机体炎症、参与免疫，并可以刺激肝细胞生成急性期蛋白，在应激过程中有重要的作用[7]，因此本试验以其作为检测指标。运输应激和免疫应激时，IL-6 mRNA表达都出现改变，但变化规律不同，利用ELISA检测血清中IL-6的浓度，结果显示与mRNA水平的变化一致。在许多有关应激的研究中，细胞因子在应激中表达变化也不相同，没有一个统一的变化规律。但是，也有研究表明IL-6可作为一个合适的应激标记物[8]。总的来说，细胞因子网络是一个稳态系统，受神经-内分泌-免疫网络的复杂调控，并受到应激原种类及强度的影响，在应激过程中处于一种动态的变化，导致各种应激研究中没有一个统一的变化规律。综上所述，细胞因子虽然在应激过程中有所变化，但是变化的方向及幅度受众多因素的影响，不适宜作为应激的检测指标。本试验中IL-6虽然在2种应激中出现了不同改变，但也可以作为猪场的一个预警指标，高于或低于正常水平都预示着机体处于不健康的状态。

本试验中，免疫应激组和运输应激组都出现了pig-MAP mRNA上调和Apo-A1 mRNA下调的现象，据此我们又利用ELISA检测血清中的浓度，结果显示与mRNA水平的变化一致。在前期试验中，通过滴鼻的方式使8周龄仔猪感染Ⅰ型胸膜肺炎放线杆菌引起猪应激，发现Apo-A1在应激时显著下调，pig-MAP虽未发生显著上调，但也有上升的趋势，这也与本次试验中两种应激的研究结果基本一致[9]。许多研究也认为急性期蛋白可作为猪应激的检测指标，但具体急性期蛋白的种类及组合不尽相同。HEEGAARD等[10]研究了3种细菌(胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、猪滑膜支原体)、1种寄生虫(弓形虫)、1种病毒(猪呼吸和生殖综合征病毒)感染、1种无菌炎症引起的猪应激反应急性期的变化规律，最终结果显示最佳的3种蛋白质组合分别是CRP、ApoA1、pig-MAP和CRP、Apo-A1、HP，其次是2种蛋白质组合CRP、pig-MAP和Apo-A1、pig-MAP。本试验结果与之基本一致。CARPINTERO等[11]对非洲猪瘟和伪狂犬病的研究也发现，Apo-A1和pig-MAP 是适宜的检测指标。但SORENSEN等[12]对自然感染猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的猪的研究，以及对患有尾巴和耳朵咬伤、关节炎和其他急性炎症的猪的研究表明HP是最佳的标志物，但是其研究中没有涉及Apo-A1的表达改变。CARPINTERO等[13]认为Apo-A1是一种敏感的急性期蛋白，可作为检测标志物。本试验通过2种应激模型及前期的感染试验得出MAP和Apo-A1是最适宜的应激检测指标，其中MAP是正向急性期蛋白，Apo-A1是负向急性期蛋白，这2种急性期蛋白在应激过程中的变化相反，也比只有正向或负向1种急性期蛋白更加有利的去检测应激。同时，急性期蛋白的半衰期比较长，应激发生后其浓度会迅速发生显著性变化，并可在48 h甚至更久的时间内维持较高水平，这也使其更便于检测[14-15]。Apo-A1和pig-MAP的组合相对于单一检测指标可以增加应激检测的准确性，相对于3个以上检测指标组合也可以节约时间和成本。