新疆地区牛肠道病毒的病毒分离鉴定及毒株差异

古丽巴哈尔·图尔荪，张福慧，张 群，米日古丽·买吐送，董 坤,王浴光,胡俊英，常晓冉,王新平，2* (.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 30062； 2.吉林大学 人兽共患病研究所 教育部人兽共患病重点实验室，吉林 长春 30062)

牛肠道病毒(bovine enterovirus，BEV)感染是由肠道病毒引起的一种以消化道和呼吸道症状为主要特征的传染病，临床表现为发热、咳嗽、腹泻，偶尔可见流产，病情严重可导致牲畜死亡[1-3]。BEV的宿主范围较广，自然界中牛、水牛、非洲水牛、黑斑羚、山羊、负鼠和海豚等都能被BEV感染[4-5]。BEV属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，病毒粒子外观呈球形，无囊膜，由衣壳蛋白和核心RNA组成[6]。基因组为单股正链RNA，全长约为7 500 bp,两端5′和3′非编码区(untranslated regions，UTRs)在病毒复制和翻译中起重要作用[7-8]。基因组含有1个大的开放阅读框(open reading frame，OFR)，编码1个多聚蛋白。前体多聚蛋白经过蛋白水解酶作用，产生4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)[9-11]。BEV感染自1959年由MOLL等[12]首次报道以来，很多国家和地区陆续报道了本病的感染与流行[13-15]。国内李英利等[10]于2011年分离出首株F种肠道病毒；邢泽黎等[6]于2012年从吉林省发生严重腹泻的牛群分离获得国内首株E种肠道病毒HY12。近年来，随着国内养牛业的迅猛发展，有关BEV感染的报道逐渐增多。

新疆地区作为我国的畜牧大省，以农牧业经济发展为主。近年来，随着牛养殖业的快速发展，许多地区牛群发生以消化系统和呼吸系统为主要特征的疫病，给该地区的养牛业造成了较为严重的经济损失。为了确定新疆地区是否存在肠道病毒感染及肠道病毒的遗传变异，本研究应用双抗体夹心ELISA方法对新疆地区不同牛群BEV感染进行了研究，发现新疆地区的不同牛群存在程度不一的BEV感染，且分离获得3株BEV均为E种肠道病毒。该结果为进一步确定BEV新疆株的致病性研究打下了基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理BEV阳性与阴性粪便样品均为本实验室保存。待检样品为采自新疆地区(喀什、石河子、阿图什、和田、阿克苏、乌鲁木齐、库尔勒、吐鲁番)疑似BEV感染的牛群,共计740份。待检样品的处理参照文献[16-17]。采集的粪便样品以PBS缓冲液按照1∶10比例稀释后，9 000 r/min 离心10 min，收集上清，-20℃保存备用。

1.2 主要试剂及仪器检测BEV抗原试剂盒，由本实验室研发与组装[18]；酶标仪，PCR扩增仪购自Thermo公司；显微镜购自奥林巴斯公司；高保真PCR聚合酶购自TaKaRa公司。

1.3 双抗体夹心ELISA检测处理后的粪样样品按照BEV抗原试剂盒说明书进行检测，根据ELISA结果统计不同地区的阳性率。

1.4 病毒分离培养病毒分离按照文献[19-20]的方法进行。选取5份ELISA检测结果为阳性且D值较高的样品进行病毒分离。将样品稀释、离心处理后以0.45 μm微孔滤膜过滤，接种Vero细胞，37℃感作2 h，弃去接种物，用Hank’s液洗涤后加入含2% FBS的DMEM培养液。接种后，每隔6 h观察1次细胞。接种后48～72 h，收集接毒细胞并反复冻融3次，离心获得病毒液再次接种Vero细胞，重复上述操作，将病毒传至第5代。同时，以未接毒细胞作为阴性对照。

1.5 病毒TCID50的测定将收获的第5代病毒液按照10-2～10-13连续稀释，接种到铺满96孔的Vero细胞中，每孔100 μL，感作2 h后加入含有2% FBS的DMEM维持液。连续观察72 h，记录每个稀释度出现CPE孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。同时，设置重复和阴性对照。

1.6 病毒理化学特性鉴定分离毒株分别以有机溶剂(乙醚、氯仿)、不同温度(37，56和65℃)及不同pH(pH 3.0,pH 5.0和pH 7.2)进行处理，然后接种细胞，确定其对有机溶剂、温度及pH值的敏感性。

1.7 病毒的免疫学鉴定采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)进行检测[21]。病毒感染Vero细胞24 h后，用等体积丙酮与甲醇混合物于-20℃对其固定20 min，5%脱脂奶粉37℃封闭15 min，之后用含0.05%吐温的PBST洗涤3次，加入抗HY12病毒的兔源多克隆抗体，37℃感作1 h后，PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗兔的二抗，37℃感作45 min后，加入AEC底物显色液显色10 min，弃去显色液，显微镜观察并记录结果。

1.8 分离株基因片段的扩增及序列测定与分析将分离毒株接种Vero细胞，感作2 h后，加入含有2% FBS的DMEM维持液，培养观察至30%～40%细胞出现病变时，应用Invitrogen TRIzol试剂盒提取接毒细胞的RNA，并反转录获得cDNA。以RT-PCR方法扩增BEV 5′UTR基因片段，扩增引物序列为：BEV-F:5′-CTTTGCACGCCTGTT-TTCC-3′；BEV-R:5′-CACACGCTCGGAGGTTGGGATTAG-3′。

1.9 进化树分析扩增片段测序后，应用Lasergene 7.0和MEGA 7.0软件对其进行遗传进化分析，构建系统进化树。

2 结果

2.1 新疆地区BEV感染的流行病学本底应用检测肠道病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒对采自新疆地区的疑似BEV感染的牛群进行了BEV感染的检测。结果如表1所示。不同地区牛群均存在程度不同的BEV感染(7.8%～24.3%)。检测的740份样品中， 115份样品为BEV阳性，阳性率为15.54%，说明新疆不同地区牛群存在BEV感染。

表1 新疆不同地区BEV感染的检测结果 份

2.2 病毒的分离培养选取5份ELISA检测为阳性的粪便样品，接种于Vero细胞。接种细胞一般于12～24 h后出现细胞病变(CPE)，某些样品接种细胞后需要盲传2～5代才能观察到CPE。如图1所示，接毒细胞呈现皱缩变圆、脱落。初步分离得到3株毒株，分别命名为BEV-XJY48、BEV-XJZ97和BEV-XJS128。将分离获得的第5代病毒培养物离心处理后取上清液进行电镜观察，结果观察到大小为22～30 nm的病毒粒子(图1)，与小RNA病毒的形态特征相符。

A,B.毒株接种Vero细胞引起的细胞病变(400×)；C:正常细胞对照(400×)；D.电镜下观察到的病毒粒子(22～30 nm)图1 病毒感染细胞引起细胞病变

2.3 病毒TCID50的测定采用Reed-Muench法测定分离毒株的TCID50，结果显示BEV-XJY48，BEV-XJZ97，BEV-XJS128的TCID50分别为10-6.8/0.1 mL，10-7.61/0.1 mL和10-7.26/0.1 mL，均具有较高的滴度。

2.4 病毒理化学特性鉴定对分离株进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、不同温度耐热性试验、不同pH耐酸性试验，结果显示分离毒株均对有机溶剂不敏感，对高温(65℃)敏感，具有耐酸性(pH 3.0)。

2.5 病毒分离株的IPMA鉴定采用IPMA对分离毒株进行了免疫学特性鉴定。应用抗HY12肠道病毒的多克隆抗体检测分离株BEV-XJY48、BEV-XJZ97和BEV-XJS128感染的Vero细胞，结果如图2所示，与阴性血清及未接毒细胞对照相比，接毒细胞胞浆内可见明显的红色着染，表明分离毒株与肠道病毒HY12毒株具有免疫学交叉，为肠道病毒。

图2 IPMA试验鉴定结果(400×)

2.6 分离株5′UTR基因片段扩增应用BEV的5′UTR特异性引物对分离毒株BEV-XJY48、BEV-XJZ97、BEV-XJS128分别进行RT-PCR扩增，结果如图3所示，获得了预期大小的目的片段。

2.7 分离毒株基因序列的测定及进化树分析应用Lasergene 7.0和MEGA 7.0软件对BEV-XJY48、BEV-XJZ97、BEV-XJS128测定的5′UTR序列与其他毒株序列进行比较(图4)，并构建遗传进化树(图5)。结果显示分离毒株BEV-XJY48、BEV-XJZ97和BEV-XJS128与BEV-LC-R4的同源性最高，达到93.37%，属于同一个分支；与BEV HY12毒株的同源性达到90.34%，且均属于E种肠道病毒。

○表示肠道病毒HY12毒株；▲表示分离毒株BEV-XJZ97；◆表示分离毒株BEV-XJS128；■表示分离毒株BEV-XJY48图5 邻近法对新分离BEV毒株及国内外BEV代表株5′UTR序列的进化树分析

3 讨论

BEV感染作为国内新发传染病，给国内养牛业造成了较为严重的危害。国内学者先后对山东、宁夏、吉林、内蒙古、河南等地BEV感染进行了流行病学调查，并确定上述地区存在不同程度BEV的感染[21]。作为我国养牛业生产快速发展的大省之一，新疆地区的牛群是否存在肠道病毒感染目前尚未见报道。

本研究应用ELISA和RT-PCR方法对新疆地区BEV感染进行了流行病学调查，通过检测新疆不同区域牛场的740份粪便样品，确定出新疆不同地区牛群均存在不同程度的BEV感染，阳性率高达15.54%。同时将部分阳性粪便样品接种于Vero细胞，分离获得到了3株肠道病毒，通过电镜观察可见典型的小RNA病毒粒子形态。应用HY12毒株的高免血清进行IPMA，发现分离的3株病毒与HY12具有较强的免疫学交叉反应，表明分离毒株为BEV。本研究应用RT-PCR方法对分离的BEV-XJY48、BEV-XJZ97、BEV-XJS128的5′UTR序列进行了扩增与进化分析，结果显示分离的3株病毒株与E种肠道病毒BEV-LCR4的同源性最高，属于同一分支，表明分离到的BEV为E种肠道病毒。有关分离新疆BEV毒株究竟属于哪一基因亚型，有待于今后进一步对病毒完整基因组序列的破译与分析。

本研究首次确定了新疆地区牛群BEV感染的流行病学本底，发现不同的牛群均存在BEV感染，该结果补充了国内BEV流行病学研究资料，为新疆地区BEV感染的防控提供了重要理论依据。