活络骨康丸对兔酒精性股骨头坏死骨特异性碱性磷酸酶和骨钙素的影响

王国宾　王少华

【摘 要】目的：探讨活络骨康丸治疗兔股骨头坏死对成骨指标骨特异性碱性磷酸酶（BALP）和骨钙素（BGP）的影响，分析药物作用靶细胞。方法：将30只日本大耳白兔随机分为实验组、模型对照组和空白对照组，每组10只。实验组和模型对照组给予白酒（酒精度为46%vol）10 mL·kg·d灌胃90 d后，实验组停止白酒灌胃，改用活络骨康丸0.84 g·kg·d灌胃60 d;模型对照组改为正常饲养60 d。空白对照组给予质量分数为10%的葡萄糖溶液10 mL·kg·d，持续灌胃90 d后，改为正常饲养60 d。150 d后，3组静脉采血，测定BALP和BGP浓度，取双侧股骨头显微镜下观察骨组织。结果：显微镜下可见实验组骨小梁连续、模型对照组骨小梁大量破坏。实验组BALP和BGP浓度值均高于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：活络骨康丸治疗酒精性股骨头坏死，能够抑制骨髓间充质干细胞成脂化，促进成骨细胞功能，分泌合成BALP和BGP。

【关键词】 股骨头坏死;活络骨康丸;骨特异性碱性磷酸酶;骨钙素;白兔

Changes of Bone-specific Alkaline Phosphatase and Bone Gla Protein in Rabbits with Alcoholic Necrosis of Femoral Head Treated with Huoluo Gukang Wan（活络骨康丸）

WANG Guo-bin，WANG Shao-hua

【ABSTRACT】Objective：To investigate the changes of bone-specific alkaline phosphatase（BALP）and bone gla protein（BGP）in rabbits with osteonecrosis of femoral head treated by Huoluo Gukang Wan

（活络骨康丸），and to analyze the target cells of drugs.Methods：Thirty Japanese white rabbits were randomly divided into an experimental group，a model control group and a blank control group，with 10 rabbits in each group.The experimental group and the model group were given 10 mL·kg·d of strong liquor（containing 46% alcohol，vol）.After 90 days，liquor for the experimental group was changed into Huoluo Gukang Wan（0.84 g·kg·d）for 60 days，the model group was normally fed for 60 days.The blank control group was given 10 mL·kg·d of 10% glucose solution by gavage for 90 days，and then changed to normal feeding for 60 days.After 150 days，blood samples were taken from 3 groups and the concentrations of BALP and BGP were measured. The bilateral femoral heads were taken and the bone tissues were observed under the microscope.Results：Under the microscope，the trabeculae in the experimental group were continuous，and the trabeculae in the model group were destroyed.The concentrations of BALP and BGP in the experimental group were higher than those in the model group（P < 0.05）.Conclusion：Huoluo Gukang Wan can treat alcoholic necrosis of femoral head，inhibit the adipogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells，promote the function of osteoblasts，and secrete BALP and BGP.

【Keywords】 osteonecrosis of femoral head;Huoluo Gukang Wan（活络骨康丸）;

bone-specific alkaline phosphatase;bone gla protein;white rabbit

股骨头坏死根据病因的不同分為创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死，非创伤性股骨头坏死又以酗酒和大量应用激素为主要危险因素[1-2]，治疗上防止股骨头塌陷、避免进行人工关节置换术是主要目标[3]。活络骨康丸应用临床三十余年，能改善股骨头内的血流微循环，促进缺血坏死区骨组织的修复和再生[4-6]。活络骨康丸主要成分是丹参、地龙、黄芪、赤芍、当归、何首乌、熟地黄等，主要功效是破瘀血、通经络、止痛行气、滋补肝肾、壮筋骨。课题组早期细胞学实验表明，离心提取的含活络骨康丸药物血清能抑制酒精诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）分化成脂肪细胞，促进其成骨分化，抵抗酒精对机体造成的毒性作用[4]。本研究通过活体动物实验模型观察活络骨康丸是否对成骨细胞有作用，现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 日本大耳白兔30只，2～3月龄，体质量（2.2±0.2）kg，雄性，SPF级，购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司。实验动物生产许可证号SCXK（鄂）2016-0011。兔均饲养于正常生活环境，饲料喂养，予自由饮食、饮水。

1.2 实验材料 全价营养饲料（河南省实验动物中心生产）;活络骨康丸[豫药制字Z20120433（郑），郑州市骨科医院];骨特异性碱性磷酸酶（BALP）、骨鈣素（BGP）（上海酶联生物科技有限公司）;牛栏山二锅头白酒（酒精度为46%vol，北京牛栏山酒厂）。

1.3 分组和造模方法 将30只白兔随机分为实验组、模型对照组和空白对照组，每组10只。参考文献[7-9]适应性饲养2周，称重。实验组和模型对照组给予白酒10 mL·kg·d灌胃，90 d后实验组改用活络骨康丸（纯净水溶解后）灌胃，参照人和动物按体表面积折算出的等效剂量比值表计算出给药量为0.84 g·kg·d，连续灌胃60 d;模型对照组改为正常饲养60 d。空白对照组用质量分数为10%葡萄糖溶液10 mL·kg·d连续灌胃90 d，然后改为正常饲养60 d。上述灌胃操作固定人员执行，且每日固定时间段进行。

1.4 取 材 150 d后3组静脉采血，给予质量分数为3%戊巴比妥钠40 mg·kg，腹腔注射，麻醉后取双侧股骨头。

1.5 ELISA法测定BALP、BGP 将采集的静脉血室温自然凝固，15 min后放入离心机，以2500 r·min离心15 min，离心半径6.1 cm，收集上清液;按照试剂盒使用说明书操作测定BALP、BGP浓度。

1.6 造模成功标准 股骨头组织HE染色后，根据骨微观结构判定是否有骨坏死形成。骨小梁骨折情况通过骨松质髓腔个数反映，显微镜下单个视野内骨髓腔数越少，证明有较多的骨小梁断裂形成髓腔连续。骨松质髓腔计数方法：每侧股骨头纵向切，分为3份形成4个切面;HE染色，40倍显微镜下，每个股骨头读取3个切面;每个切面观察2个显微镜视野平面，各个股骨头共计观察6个显微镜视野平面;计数每个视野平面骨松质髓腔，取其6个视野平面的骨松质髓腔数均值即为一个股骨头骨松质髓腔数。骨松质髓腔计数原则：①排除隨腔最大径线低于电脑画图软件100像素的腔隙，该条件为前提;②独立的1个或者在视野边界的半个（不完整的）骨松质隨腔计数为1个。不完整的髓腔是指：与视野内独立髓腔不连通且应符合100像素以上的最低径线长度标准。

1.7 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行统计分析。3组样本统计方法为单因素方差分析，计量资料以表示，组间比较采用LSD检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组白兔股骨头大体观察 实验组及模型对照组分别意外死亡2只和1只，解剖后显示为肺部坏死导致的死亡。空白对照组意外死亡2只，死亡原因不详。3组股骨头外形光滑完整，软骨表面未见损伤。股骨头被制作切片过程中，股骨头内无明显缺失，可见红色骨髓，未见黄色骨髓，骨松质髓腔无明显增大。

2.2 3组白兔股骨头HE染色病理结果及骨松质髓腔数比较 实验组镜下可见骨小梁变细，骨小梁未见明显中断，骨松质髓腔数与空白对照组比较，差异无统计学意义（P ﹥0.05）。模型对照组镜下可见骨质破坏严重，骨小梁中断明显，骨松质髓腔数明显低于空白对照组（P ﹤0.01）;骨髓腔内造血细胞减少，说明有严重的骨松质吸收、缺失。空白对照组镜下骨小梁完整连续、骨松质髓腔镜下独立完整、软骨表面完整无损伤。见图1、表1。

2.3 3组白兔BALP和BGP血清浓度比较 实验组BALP血清浓度高于空白对照组，实验组高于模型对照组，模型对照组低于空白对照组，差异均有统计学意义（P ﹤0.05）。实验组BGP血清浓度比空白对照组高，差异有统计学意义（P ﹤0.01）。

实验组BGP血清浓度高于模型对照组，模型对照组低于空白对照组，差异均有统计学意义（P ﹤0.05）。见表2。

3 讨 论

本研究探讨活络骨康丸对兔酒精性股骨头坏死BALP和BGP的影响，采用长期大量服用烈性白酒进行股骨头坏死模型造模，其原因：第一，尽最大可能更好地还原活体动物对于酒精的反映情况，有利于骨代谢的相关指标检测;第二，酒精性股骨头坏死[10]MSCs的活性并不会丧失。股骨头坏死模型的制作有很多种[11-12]，大剂量应用激素也可以制作股骨头坏死模型，但会造成MSCs失去活性，并不适合该实验研究。同样液氮冷冻等快速造模方法类似于创伤性股骨头坏死，不在本实验研究的范围内。本次实验造模时间为3个月，宏观上股骨头并没有出现明显改变，股骨头未见塌陷、骨软骨缺损等表现;仅有镜下改变，主要包括软骨区、软骨下区及坏死区的病理变化。本实验研究病理结果显示，软骨区：实验组没有表现出软骨破坏、分离，但有潮线分离现象，说明有轻微软骨损伤;模型对照组表现为软骨破坏缺失，软骨和骨分离;空白对照组镜下表现正常。软骨下区：实验组镜下可见骨小梁变细，骨小梁未见明显中断，实验组骨松质髓腔数与空白对照组骨松质髓腔数比较，差异无统计学意义（P ﹥0.05）;模型对照组骨小梁镜下可见明显中断，骨质破坏严重，模型对照组骨松质髓腔数低于空白对照组（P ﹤0.01）;空白对照组无异常。坏死区：实验组镜下未见坏死后软骨内成骨，表明不存在大范围骨坏死;模型对照组镜下可见明显的软骨内成骨，说明有坏死后的反应性成骨;空白对照组骨质无异常。以上病理结果显示，骨坏死模型制作成功，活络骨康丸可以防治股骨头坏死。活络骨康丸主要成分有地龙、当归、赤芍、丹参、黄芪、何首乌、熟地黄等，君药破瘀通经、引气止痛，臣药补气血、滋阴壮阳、醒脾和胃以扶正气，佐以活血引经药，使以调和诸药。君臣佐使共同发挥破瘀血、通经络、行气止痛、滋补肝肾、壮筋骨的作用。有研究表明，髋关节置换患者术后服用该药，能够改善血流动力学指标[5]。有学者应用活络骨康丸和经皮椎体成形术联合治疗椎体压缩性骨折，结果显示，患者远期椎体高度未见减少，骨密度增高[13]。有研究将活络骨康丸与骨疏康治疗老年骨质疏松进行对比研究，结果显示，活络骨康丸可以治疗骨质疏松症[14]。实验显示，活络骨康丸能够降低血脂、抑制MSCs成脂化[4]。

本研究為动物活体实验，结果显示，实验组BALP和BGP浓度值均高于模型对照组和空白对照组（P ﹤0.05），模型对照组低于空白对照组（P ﹤0.05）。骨代谢指标[15]包括4类：骨形成标志物、钙磷代谢调节指标、激素与细胞因子、骨吸收标志物。骨形成标志物指标中，BALP由成骨细胞合成，是细胞外酶的一种，主要作用体现在成骨过程中参与水解磷酸酶;羟基磷灰石的沉积需要磷酸的参与。BALP还可以水解焦磷酸盐，焦磷酸盐的存在能抑制骨盐形成，焦磷酸盐被水解后有利于成骨。BGP来源主要是成骨细胞、增生的软骨细胞、成牙质细胞。BGP是反映骨形成的特异性生化指标，参与成骨细胞分化和基质矿化，与骨转换相关[16];能够维持骨的正常矿化速率，抑制软骨的矿化速率，并能抑制骨内异常的羟磷灰石结晶形成。由于BALP、BGP来源相对单一，都是由成骨细胞合成，因此不像其他骨形成标志物如骨保护素来源于成纤维细胞、成骨细胞、骨髓基质细胞等多种细胞，不方便实验数据的观察。国内外研究常用BALP、BGP等骨形成指标评价成骨细胞生成骨质情况[17-20]。以上结果说明，活络骨康丸促进成骨细胞的功能，可以提高骨形成指标BALP和BGP的血清浓度值。但本研究是动物实验，活络骨康丸在临床上的应用仍然需要进一步研究。

综上所述，活络骨康丸能够治疗酒精性股骨头坏死，抑制MSCs成脂化，提高成骨细胞功能，分泌合成BALP和BGP。

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收稿日期：2022-03-08;修回日期：2022-04-19