血清miRNA-196a、miRNA-92a 表达水平与宫颈癌根治术后复发的关系

王雨村 胡拓阳 崔 静 韩 萍 丁 燕

1.甘肃省肿瘤医院妇瘤二科，甘肃兰州 730050；2.甘肃省肿瘤医院放射科，甘肃兰州 730050

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大常见女性恶性肿瘤[1-2]。外科手术仍然是当前宫颈癌最重要的治疗手段，但术后面临较高的复发风险[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类不编码蛋白质的RNA，其可通过调节各种基因表达，进而影响细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生物学过程，与肿瘤发生、发展密切相关[4]。miRNA-196a、miRNA-92a 为miRNA 家族成员之一，miRNA-196a 在胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤细胞中表达上调[5-6]，miRNA-92a 在非小细胞肺癌、肝癌等恶性肿瘤细胞中表达上调[7-8]，与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移相关。本研究旨在分析血清miRNA-196a、miRNA-92a水平与宫颈癌根治术后复发及预后的关系，以期为宫颈癌诊治提供新的策略。

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1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年1 月至2016 年6 月甘肃省肿瘤医院（以下简称“我院”）收治的113 例行宫颈癌根治术患者为宫颈癌组，年龄24～68 岁，平均（45.15±5.36）岁。纳入标准：①经术后病理确诊为宫颈癌；②初次确诊，未接受放化疗等治疗；③国际妇产科联盟（Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期[9]ⅠA～ⅡA；④临床资料和随访资料完整；⑤患者及家属均知情同意。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②严重心、肝、肾等脏器疾病；③血液、免疫系统疾病；④全身感染性疾病；⑤妊娠及哺乳期妇女。另选取我院68 名体检健康女性为对照组，年龄18～70 岁，平均（45.07±5.24）岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准（伦理号：20181201）。

1.2 研究方法

采集患者术前和对照组体检时空腹静脉血，3000 r/min 离心10 min（半径10 cm），取上清保存于-80℃冰箱中，TRIzol 总RNA 抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司；货号：B511321-0020）提取血清总RNA，超微量分光光度计鉴定RNA 纯度为OD260/OD280为1.8～2.0，Takara 逆转录试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司；货号：RR037A）转录合成cDNA，使用美国伯乐CFX qRT-PCR 仪和qRT-PCR 试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司；货号：JN0052）进行qRTPCR 扩增。miRNA-196a 正向引物序列5’-CGTCAGAACGAATGATGCACAG-3’，反向引物序列5’-ACCTGCCTAGGTACTTTCATGT-3’；miRNA-92a 正向引物序列5’-AGCTCTACGACTGTCACTCG-3’，反向引物序列5’-GTATGCATTCTATCGTAG-3’；内参U6 正向引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应体系：7.5 μl SYBR GreenⅠMaster、1.0 μl 上游引物、1.0 μl下游引物、2 μl DNA 模板、8.5 μl RNase-Free H2O；反应条件：95℃预变性30 s 循环1 次，95℃5 s，60℃35 s，72℃30 s，循环40 次。2-ΔΔCt法计算血清中miRNA-196a、miRNA-92a 相对表达量，连续检测3 次，取平均值。根据血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平均值将宫颈癌组分为高表达和低表达。

1.3 随访

宫颈癌患者术后定期进行B 超、计算机断层扫描、磁共振成像等检查，每6 个月1 次。统计宫颈癌复发情况，包括局部复发和远处转移，局部复发指切除病灶范围内出现新的宫颈癌病灶，远处转移至出现远处转移病灶。随访截至2021 年6 月。

1.4 统计学方法

随访11～60 个月，中位38 个月，截至末次随访，113 例宫颈癌患者术后复发25 例（22.12%），miRNA-196a、miRNA-92a 高表达的复发率高于低表达，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3、图1。

2 结果

2.1 两组血清miRNA-196a、miRNA-92a 表达比较

健全顺畅高效的协调机制。充分发挥“双重领导”优势和军地桥梁纽带作用，协调军地各级建立常态化的计划协调、联席会议、联合办公、情况通报、双向走访等制度，使军队能够实时了解地方经济社会发展进程、建设规划、科技立项和技术革新等现状，也使地方能及时掌握军队需求，切实调动军地双方力量协力推进军民融合发展各项工作有效落实。

路桥在施工过程中应严格把控好质量关，这就要求施工人员选择质量较高的材料。其中石子的选择尤为重要，应选择配比良好的石子，控制其砂粒径与含量，不仅能够降低混凝土空隙率和收缩量，而且可提高混凝土强度[3]。此外，定时对混凝土进行养护也可提高施工质量，这也是整个施工过程中较为重要的环节，提高混凝土强度，从而避免失水而出现裂缝问题。同时，由于环境的问题，在对较多混凝土进行保养时一般温度较高，这时采用浇水降低温度，也能在一定程度上提高施工质量，避免混凝土裂缝问题。

表1 两组血清miRNA-196a、miRNA-92a 表达比较（）

注 miRNA：微小RNA

2.2 宫颈癌患者临床病理特征与血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平的关系

ROC 曲线显示，miRNA-196a联合miRNA-92a预测宫颈癌根治术后复发的AUC 大于两者单独预测（Z=2.319、2.582，P=0.020、0.010）。见表6、图1。

表2 宫颈癌患者临床病理特征与血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平的关系（）

注 FIGO：国际妇产科联盟；miRNA：微小RNA

2.3 不同血清miRNA-196a、miRNA-92a水平宫颈癌患者复发率比较

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验。正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t检验。影响因素采用多因素Cox 回归分析。预测价值采用受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线计算曲线下面积（area under the curve，AUC），比较采用Z 检验；采用Kaplan-Meier 分析生存时间。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

宫颈癌组血清miRNA-196a、miRNA-92a 表达高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表3 不同血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平宫颈癌患者复发率比较[例（%）]

2.4 影响宫颈癌根治术后复发的单因素及多因素Cox回归分析

差异因素为自变量，随访时间为时间变量，复发（是=1，否=0）为因变量。FIGO 分期ⅡA 期、间质浸润深度≥1/2、淋巴结转移、miRNA-196a≥5.239、miRNA-92a≥1.816 是宫颈癌根治术后复发的独立影响因素（P ＜0.05）。见表4～5。

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表4 影响宫颈癌根治术后复发的单因素Cox 回归分析[例（%）]

2.5 血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平对宫颈癌根治术后复发的预测价值

不同FIGO 分期、间质浸润深度、淋巴结转移的宫颈癌患者血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

图1 血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平预测宫颈癌根治术后复发的ROC 曲线

表6 血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平对宫颈癌根治术后复发的预测价值

图1 不同血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平宫颈癌患者无复发生存曲线

表5 影响宫颈癌根治术后复发的多因素Cox 回归分析

3 讨论

术后复发是导致宫颈癌患者生存时间缩短和生命质量降低的主要原因，ⅠA～ⅡA 期宫颈癌根治术后5 年复发率为10.0%～20.0%[10]。宫颈癌术后监测旨在及早发现复发，提升患者生存率和生命质量，但目前尚无高级别证据支持最佳监测策略，因此亟须探索宫颈癌术后复发相关生物标志物[11]。

miRNA 是一类非编码单链小分子RNA，能通过与靶基因mRNA 的3’-非翻译区负反馈调节靶基因的表达[4]。近年来，越来越多的研究表明，miRNA 与宫颈癌发生、发展有密切关系，可通过靶向特定的癌基因或抑癌基因来调控肿瘤进展中的重要功能[12-16]。miRNA-196a 基因定位于HOX 基因簇，研究表明miRNA-196a 异常表达与多种恶性肿瘤发生、发展相关[17-18]。本研究结果显示，宫颈癌组血清miRNA-196a高表达，且与FIGO 分期、间质浸润深度、淋巴结转移有关，提示miRNA-196a 在宫颈癌中可能发挥致癌基因作用。miRNA-196a 高表达复发率更高，是复发的危险因素，表明miRNA-196a 与宫颈癌术后复发转移密切相关。梁燕等[19]研究报道，宫颈癌组织中miRNA-196a 上调，抑制miRNA-196a 表达能抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，验证了本研究结果。其机制可能与miRNA-196a 能靶向孤儿核受体亚家族6 成员1、Lrig3，增强宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力和抑制细胞凋亡，促进宫颈癌根治术后复发有关[19-20]。

miRNA-92a 为miR-17-92 基因簇成员，miR-17-92 基因簇是首个被发现的miRNA 癌基因。因此，有研究报道了miRNA-92a 在恶性肿瘤中的作用[21-22]。本研究显示，宫颈癌组血清miRNA-92a 高表达，与FIGO 分期、间质浸润深度、淋巴结转移有关，提示miRNA-92a 在宫颈癌中可能发挥致癌基因作用。本研究结果还显示，miRNA-92a 高表达复发率更高，是复发的危险因素，提示miRNA-92a 与宫颈癌术后复发密切相关。研究显示，miRNA-92a 在宫颈癌细胞中高表达，干扰miRNA-92a 表达能通过下调生存素和基质金属蛋白酶2 表达抑制宫颈癌细胞增殖和促进凋亡，但关于其靶向机制不明[23]。磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1 是重要的抑癌基因，能负向调节肿瘤细胞生长、侵袭、迁移过程[24]。Wang 等[25]通过荧光素酶报告基因证实宫颈癌中miRNA-196a 能靶向下调磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1 促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示miRNA-196a 可能靶向磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1，促进宫颈癌根治术后复发。本研究显示，miRNA-196a 联合miRNA-92a 预测宫颈癌根治术后复发的AUC 大于两者单独预测，说明血清miRNA-196a、miRNA-92a 水平均能作为宫颈癌根治术后复发的预测指标，且联合检测能更好地指导宫颈癌治疗。

综上所述，宫颈癌血清miRNA-196a、miRNA-92a水平升高，二者与FIGO 分期、间质浸润深度、淋巴结转移、复发有关，可作为宫颈癌根治术后复发的预测指标。但关于miRNA-196a、miRNA-92a 影响宫颈癌根治术后复发的相关机制尚不明确，还需进一步研究。