非洲猪瘟检测方法研究进展

付云龙

（河南先研生物科技有限公司，河南 郑州 450000）

0 引言

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的一种毁灭性的猪出血热，患病猪死亡率接近100%。由于非洲猪瘟的高发病率和高死亡率及缺乏有效的疫苗，该病原体对全球养猪业和国家经济构成严重威胁。

1 ASFV

ASFV基因组是线性双链DNA分子，长度在170～193 kb，包含150～167个开放阅读框，编码170多种蛋白。ASFV基因组有3个区域，中心区域是一个保守区域，两侧是两个可变区域。ASFV具有多种基因型，目前已鉴定出8个血清型和24个基因型。

2 ASFV传播及流行

ASFV可感染家猪和野猪，包括非洲疣猪、丛林猪和欧亚大陆的野猪。鸟类已被确认为ASFV的生物载体和宿主。ASFV易通过受污染的猪肉产品和混合饲料进行传播。

ASF于1909年在非洲肯尼亚首次被描述，几乎100%受感染的家猪死亡。在接下来的几十年里，非洲猪瘟一直局限于非洲，直到1957年在葡萄牙首次发现，1 a后被根除，但1960年又再次暴发。1995年，除意大利的撒丁岛外，欧洲多数国家通过猎杀野猪和扑杀病猪消灭了该病。该病在撒丁岛一直以地方性流行病的形式存在。1971年，非洲猪瘟越过大西洋蔓延到古巴，并在加勒比和南美洲传播，但很快得到控制并被根除。

非洲猪瘟于2007年通过高加索山脉附近的野猪群传播到俄罗斯南部。随后，在2008年，俄罗斯的家猪受到感染，并迅速蔓延到俄罗斯西部和北部。2014年初，非洲猪瘟通过野猪携毒从俄罗斯传播到欧盟国家，特别是波兰。非洲猪瘟继续向西南传播，分别于2016年传播到摩尔多瓦和匈牙利，2017年传播到达捷克和罗马尼亚。2018年至2020年12月，比利时、希腊和德国等欧洲国家发生了新的非洲猪瘟疫情。

2018年8月，我国首次发生非洲猪瘟。从我国分离到的菌株属于基因型Ⅱ，与目前在俄罗斯和东欧流行的菌株相似。2018年至2020年12月，多数亚洲国家暴发非洲猪瘟，并向世界动物卫生组织报告。

3 ASFV检测

3.1 病原分子生物学诊断

3.1.1 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）。传统的PCR检测是国际兽疫局认可的常规核酸检测方法之一，并广泛应用于实验室诊断。该方法具有简便、快速、灵敏度高、特异性强及对样品纯度要求低等优点。基于VP73基因序列的7种不同ASFV毒株，Aguero等设计了特定的引物，并建立了一种ASFV PCR鉴定方法。该方法的敏感性高于2010年世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）《诊断试验和疫苗标准手册》推荐的方法，适用于检测世界范围内几乎所有的ASFV毒株。蜱类在非洲猪瘟的传播中起着重要作用，为此，研究人员建立了一种巢式PCR检测方法，用于检测野生蜱是否携带ASFV DNA。多重PCR原理与常规PCR基本相同，能够同时检测多种病毒而不发生交叉反应，对猪的多种病毒感染检测具有重要的指导意义。Erickson 等人建立了一种新型的伴随自动化电子芯片检测方法，可同时检测猪的7种疾病，具有快速、高通量的检测特性。多重PCR检测的特点是可同时进行大量的生物试验，可实现高通量、高速度检测。但是，其检出率低、成本昂贵且易交叉污染出现假阳性结果。

3.1.2 实时荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，RT-PCR）。实时荧光定量PCR是目前首选的病原检测方法，也是ASFV检测的金标准。该方法准确、灵敏、时间短，适合实验室诊断。

3.1.3 等温扩增技术。常见的ASFV等温扩增技术有重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）、环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、交叉引物扩增（Crossing Priming lsothermal Amplification，CPA）等。RPA是由英国公司TwistDx开发的基于重组酶的等温扩增技术，具有灵敏、快速、操作简单等特点。LAMP是一种适用于基因诊断的新型核酸扩增技术，由日本学者Notomi于2000年开发。LAMP具有操作简单、灵敏度高的特点，但只能作为疑似感染区的早期诊断，不能作为最终的判断结果。CPA是一种新型核酸等温扩增技术，无需初始变性步骤，由Ustar于2008年开发。CPA检测具有灵敏度高、特异性强和广泛应用等特点，其不仅可以检测常规血液和血清中的病毒，还可以检测各种肉类产品中的病毒。

3.2 血清学诊断

血清学诊断是最常用的诊断检测方法，其操作简单、成本相对较低，且对专用设备的要求较低。目前，ASFV的血清学检测包括抗原检测和抗体检测，由于抗原检测的条件比较严格，抗体检测逐渐成为血清学诊断的主流方法。国际兽疫局推荐的ASFV抗体检测方法为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA），并辅以其他确证检测，如免疫印迹检测（Immunoblotting Test，IBT）、间接荧光抗体检测（Immunofluorescence Assay，IFA）和间接免疫过氧化物酶检测（Indirect Immunoperoxidase Test，IPT）。

3.2.1 基于抗原的检测

3.2.1.1 荧光抗体检测（Fluorescent Antibody Tests，FAT）。FAT是常用的抗原检测方法之一，能够识别不吸附血液的ASFV毒株。该方法对急性感染具有检测快速、高灵敏度、高特异性及高检出率等优点。FAT对亚急性和慢性ASF不敏感，原因可能是在慢性感染过程中，抗原抗体复合物竞争性地阻断了ASFV抗原与抗体的结合，导致出现假阴性。因此，一般FAT只作为一种辅助检测方法。

3.2.1.2 直 接ELISA检 测（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。基于单克隆抗体涂层的直接ELISA可以直接检测ASFV抗原，但只推荐用于急性病例检测，其对于亚急性和慢性感染的动物，敏感性显著降低。这可能与感染猪组织中抗原抗体复合物的产生有关。随后，研究人员陆续建立了抗血清直接ELISA、基于VP73单克隆抗体的夹心ELISA、用于抗原检测的横向流动分析法（Lateral Flow Assay，LFA）。直接ELISA检测是以抗ASFV蛋白P72单克隆抗体为捕集剂，其敏感性与商业抗原ELISA相似。此外，该方法可早期检测出ASFV感染，特别适合于大规模的现场筛选和检测。

3.2.2 基于抗体的检测

3.2.2.1 间接ELISA检测。免疫电渗电泳（Immunoelectroosmophoresis，IEOP）试验是实验室中最早用于诊断ASFV的血清学方法之一。IEOP试验在检测ASFV抗体方面优于互补固定试验和琼脂凝胶扩散试验，但需要从感染ASFV的Vero细胞提取物中制备抗原。IEOP测试费时费力，不宜应用于大规模调查。间接ELISA具有灵敏度高、操作简单等优点，已取代IEOP成为检测大量血清ASFV最合适、最常用的方法。但存在因动物直接死亡或感染后存在病毒免疫复合物而导致的假阴性诊断问题。

如果要通过ELISA法获得更准确的诊断结果，就必须进行更可靠的固相载体和纯化抗原。Tabares等报道了半纯化的ASFV主要衣壳蛋白VP73的制备，大大提高了ELISA作为包被抗原的可靠性。与半纯化的P73相比，血清样本中的ASFV抗体使用粗抗原至少提前两天检测。Oviedo等通过杆状病毒表达重组蛋白P30和P54，验证了它们在ELISA和免疫印迹试验（IBT）中的检测效果，认为P30更适合作为ELISA的抗原。相反，P54应该被用作IBT的抗原。此外，将P54和P30蛋白联合应用于ASFV血清学诊断可提高敏感性。Filgueira等利用杆状病毒载体在昆虫幼虫中建立了基于重组蛋白P30的ELISA检测。在实验感染动物早期检测ASFV特异性抗体，比世界动物卫生组织推荐的ELISA检测更敏感。Gallardo等发现ASF病毒多蛋白pp62具有良好的抗原性，基于该蛋白pp62的ELISA检测具有良好的反应原性。特别是在检测保存较差的样品时，pp62的检测准确性明显优于蛋白P30和P54，甚至不需要通过IBT确认结果。Gallardo等评估了4种ASFV重组蛋白（pA104R、pB602L、P54和pK205R）作为ELISA诊断工具在欧洲和非洲样本ASFV血清学诊断中的作用。重组蛋白ELISA检测结果与世界动物卫生组织批准的结果一致。其中，来自东非的血清样本具有较高的特异性，但敏感性却很低。东非地区血清对ASFV感染反应低的原因尚不清楚，有报道称，不同品种的猪可能有不同的免疫谱系、克隆缺失、猪白细胞抗原类型或先天免疫机制。

3.2.2.2 间接荧光抗体（IFA）、间接免疫过氧化物酶（IPT）、斑点免疫结合试验（Dot Immunobinding Assay，DIA）。IFA是一种快速、高灵敏度和特异性强的ASFV抗体检测技术，适用于血清、血浆或组织分泌物中的抗体检测。IFA检测比ELISA检测更敏感，可在血清学反应早期检测ASFV抗体。特别是在感染早期，当感染动物几乎没有抗体时，IFA和IPT为血清学诊断提供了良好的选择。IPT的原理与IFA相似，不同之处是IPT采用酶显色系统，更容易判断。

检测血清时，因细胞中含有抗体，未感染的细胞也会发出荧光。因此，在解释结果时可能会出现混淆，从而得出错误的诊断。Pan等开发了一种间接免疫过氧化物酶斑块染色（Indirect Immunoperoxidase Staining，IIPS）方法。它具有IPT的所有主要特征，结果可以在普通光线下用裸眼直接读取，每天可进行400次测试。

Pastor等人在斑点免疫结合试验（DIA）的基础上，研制了一种硝酸纤维素试纸条检测ASFV，用于现场检测抗体。DIA的工作原理与ELISA相似，将ASFV的可溶性抗原涂在硝酸纤维素试纸上，与血清样本发生反应。它可以通过蛋白A过氧化物酶结合物检测抗体。与其他血清学检测方法相比，DIACS-P具有简单、快速、成本低的优点，可在现场条件下对疑似潜伏性猪瘟感染的猪进行筛选。

3.2.2.3 免疫印迹试验（IBT）。IBT是替代IFA检测ASFV抗体的一种方法，其灵敏度甚至优于IFA。Kazakova等为了避免传统IBT抗原中含有细胞蛋白引起的假阳性反应及未纯化的重组蛋白和原核细胞表达的蛋白对结果的影响，将蛋白P30与6xHis标签连接，层析纯化得到高纯度重组蛋白P30，建立了用于ASFV血清学诊断的免疫印迹试验方法，使检测的特异性和敏感性得到显著提高。

每种诊断技术都有其独特的特点，为ASFV的诊断提供了多种选择。有些技术具有较高的灵敏度和特异性，但可能受到昂贵的实验设备的限制，如PCR和FAT。一些诊断技术，如ELISA，敏感性和特异性较差，但成本较低。ASFV常规实验检测技术的特点如表1所示。

表1 ASFV常规实验检测优缺点

4 讨论和结论

非洲猪瘟给养猪业和世界经济造成了严重损失，由于目前没有可用的疫苗，非洲猪瘟的预防和控制已成为最紧迫和最难解决的问题。目前，非洲猪瘟防控是早发现、早报告、早处理，这是控制和根除非洲猪瘟的重要手段。近年来，ASFV的诊断方法得到了多种发展，并显示出良好的诊断效果。

PCR和Real-time PCR仍是诊断ASFV感染最可靠的方法，其中Real-time PCR被认为是金标准。等温扩增技术抵消了昂贵的实验室设备的限制，但其敏感性和有效性仍需通过大量的临床诊断数据进行验证。等温扩增技术与CRISPR-Cas12a的结合也具有良好的发展潜力。ELISA具有检测快速、操作简单、成本相对较低的优点，是目前应用最广泛的ASFV检测方法。ELISA适用于急性病例，对慢性病例的检出率不高。因此，对于ELISA检测阳性的样品，建议采用核酸检测、免疫印迹或间接荧光抗体检测进行确认。目前，商用的ELISA试剂盒主要基于蛋白P30、P54、P72和pp62，其中蛋白P30被认为是最适合用于免疫吸附试验的。目前，基于ASFV抗原检测的侧流装置已经研制成功。另外，等温扩增技术是21世纪新兴的核酸扩增技术。该技术基本满足了目前现场对ASFV检测的需求，在现场诊断中具有很大的应用前景。但是，这种方法是单通道检测，很难实现数百个或数千个样本的同时检测。鉴于此，以多通道快速检测为例，结合电子芯片技术将成为该技术未来的发展方向。