油樟内生真菌有效分离和培养关键技术

胡连清，周万海，冯瑞章，陈雨薇，刘雯雯，龚云飞，张继红

（1.宜宾学院农林与食品工程学部，四川宜宾 644000；2.四川省油樟工程技术研究中心，四川宜宾 644000；3.简阳市农业技术推广中心，四川简阳 641400）

油樟(Cinnamomum longepaniculatum(Gam-ble)N.Chao 是中国特有的樟科樟属常绿乔木，其根、茎和叶含有桉叶油素、芳樟醇、樟脑等芳香油，可以制作香料、食品添加剂、医药等，具有重要经济价值[1-3]，是我国重要的经济树种. 已有研究表明，油樟精油的主要成分具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用[4-5]，油樟本身的植物病害也少，这些特性都可能与油樟的内生真菌有关.

植物内生真菌（endophytic fungi）指生活史中的某一个阶段或整个阶段寄生在宿主植物的组织内或细胞间隙中，而不会导致宿主病害症状的真菌[6-7].几乎所有的存活植物体内都有内生真菌的存在，植物和内生真菌能够合成多种具有重要价值的代谢产物，这些产物具有抗肿瘤活性、抗菌活性、抗重金属胁迫、抗氧化活性等多种抵御生物（病原体损伤）与非生物（干旱、高温、高盐）类胁迫的功能，能帮助植物抵御不良环境的胁迫[8]. 植物内生真菌能产生许多代谢物且具有与其宿主植物产生的代谢产物相似的功能，因而可作为新的资源来替代短缺的植物并保护濒临灭绝的天然植物物种，具有重要研究意义[9].

从植物组织中分离得到内生真菌，是研究其功能以及多样性的基础，关于内生真菌的研究都涉及从植物中分离内生真菌. 在分离植物内生真菌过程中，植物样本表面的消毒方法和培养基条件是影响分离效果的最关键因素之一. 表面消毒方法以及内生真菌分离培养时培养基选择不当都可能影响内生真菌的生长菌落数量以及真菌种类. 目前关于对油樟内生真菌有效分离和培养关键技术的研究几乎未见相关报道，因此，本研究以春、夏、秋、冬油樟四个季节的根、茎、叶为材料，设置不同的消毒条件和培养基类型，探究适宜油樟组织的表面消毒方法以及内生真菌的分离方法和培养基条件，为获得更多种类的油樟内生真菌菌株提供保障，也为后续的油樟内生真菌功能性及多样性等研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

油樟根、茎、叶样品采集时间分别为2018 年6月、2018 年9 月、2018 年12 月和2019 年3 月，采样地点为四川省宜宾市高县月江森林经营所油樟母本园（北纬28°47′77″，东经104°59′76″）；采样时根据随机取样原则选取成年健康植株5 株，取样的株距在（30～50）m，采集的根茎叶分类混合均匀装入无菌封口塑料袋，于24 h 内带回实验室启动内生真菌的分离培养. 采集到的夏季样品用于进行消毒剂种类、消毒时间、消毒程序的确定以及培养基的筛选，采集的秋、冬、春的样品采用筛选到的分离方法进行内生真菌分离、并进行分属鉴定，检验优化后分离方法的效果.

培养基分别为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、麦芽浸粉琼脂培养基（MEA）、察氏培养基（Czapek-Dox Agar）、马丁培养基（Martin Medium）、卵磷脂吐温-80 营养琼脂培养基（TTC Lecithin Tween 80 Nutrient Agar）、玉米粉琼脂培养基（CMA），油樟浸提液+PDA与胡萝卜汁+PDA.

1.2 试验方法

（1）样品制备

①油樟浸提液：取油樟的根、茎、叶分别10 g，加入100 mL 纯净水，煮沸10 min，滤渣后倒入三角瓶中保存备用.

②胡萝卜汁：取胡萝卜30 g，加入100 mL 纯净水，煮沸10 min，滤渣后倒入三角瓶中保存备用.

（2）油樟组织表面消毒方法设计

油樟根、茎、叶各样品先用自来水流水冲洗（1～2）h，无菌水冲洗3 次. 分别用75%酒精、95%酒精、3%次氯酸钠、5%次氯酸钠、75%酒精+3%次氯酸钠、75%酒精+5%次氯酸钠、95%酒精+3%次氯酸钠、95%酒精+5%次氯酸钠进行消毒，并且每个试验组设置不同的消毒时间（3 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min），最后用无菌水冲洗5 次. 收集第5次清洗后的无菌水0.1 mL 涂布至PDA 与LB 培养基进行培养，同时将经表面消毒过的油樟组织在空白平板内反复按压几次培养，26 ℃恒温箱中培养5天，以此检测表面消毒是否彻底. 根据以上试验结果确定的适宜消毒剂，参照李军勤[10]等在对南方红豆杉内生真菌分离时的表面三步消毒法设计选择表面消毒方式，并对确定的表面消毒方式进行优化，从而确定不同油樟样品最佳消毒方法.

（3）培养基配方设计

试验选用6种经典培养基与2种特色培养基，分别为PDA、MEA、Czapek-Dox Agar、Martin Medium、TTC Lecithin Tween 80 Nutrient Agar、CMA，油樟浸提液+PDA 与胡萝卜汁+PDA，各培养基的配制方法根据其培养基说明书步骤配制，其中油樟浸提液+PDA 与胡萝卜汁+PDA 培养基溶剂分别为，油樟浸提液50 mL+纯净水950 mL 与胡萝卜汁50 mL+纯净水950 mL，同时在培养基倒平板过程中，为防止细菌污染，待温度冷却到45 ℃左右，加入0.1 g/L氯霉素.

（4）接种、培养与观察

以夏季油樟根、茎、叶为样品，通过试验确定的消毒方法消毒，用无菌剪刀将周围组织裁剪丢弃，选用中部组织将根与茎剪成（2～3）mm 的斜口小段，将叶剪切成（0.5×0.5）cm 大小的组织片，接种到8 种培养基中，每种培养基接种10 个平板50 个样. 置于霉菌培养箱中22 ℃培养，培养一周后，再进行分离纯化，统计出菌数量和种类，从而选择出合适的培养基进行油樟其它季节根茎叶内生真菌的分离和纯化，选出最佳的适宜油樟根茎叶内生真菌生长的培养基. 数据结果用Excel 与Orijin2019b 软件进行处理分析.

（5）内生真菌的鉴定

①DNA 提取：利用真菌DNA 提取试剂盒提取DNA，以真菌通用引物ITS1(5′-TC-CGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和ITS4(5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物，扩增ITS 保守区域.PCR 反应体系包括：2 μL DNA 模板、1μL ITS1（10 mM）、1μL ITS4（10 mM）、25μL2×Taq PCR Master-Mix、21μL ddH2O.

②PCR 扩增：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，58 ℃退火55 s，72 ℃延伸45 s，共45 个循环，72 ℃再延伸10 min. PCR 产物用10 g/L 琼脂糖凝胶电泳进行检测. 然后送检上海生工生物工程技术服务有限公司测序. 测序结果在NCBI-BLAST 网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）对菌种进行分属鉴定.

2 结果与分析

2.1 表面消毒剂种类及表面消毒方式的选择与优化

表1 显示，通过不同时间的表面消毒后，单独使用次氯酸钠或者酒精的处理，第5 次无菌水冲洗液接种到固体平板，或者用消毒后油樟组织按压固体平板后都有菌落长出，表明表面消毒不彻底；将95%的酒精与一定浓度的次氯酸钠结合消毒的效果较优，试验平板无菌落生长，表明表面消毒彻底. 因此，95%的酒精和一定浓度的次氯酸钠搭配使用时，才能完全达到表面消毒的要求.

表1 不同消毒剂对油樟组织的消毒效果Table 1 Effect of different disinfectants on the tissue of Cinnamomum longepaniculatum

根据表1 的结果，设计三步消毒法（表2）. 通过表2 的三步消毒法对油樟根、茎、叶组织进行表面消毒，结果（表3）显示，95%的酒精+3%次氯酸钠处理在试验规定的时间内均无法达到彻底消毒的目的；在95%的酒精+5%次氯酸钠处理中，消毒效果较好，在后续试验中将采用该方式进行消毒. 然而，这种方式消毒后的油樟茎、叶组织出现褐化，可能有消毒强度太大的可能，表明对于油樟的不同组织，需在消毒时间和次氯酸钠浓度方面再作进一步的优化.

表2 油樟组织表面三步消毒法Table 2 Surface three-step disinfection of Cinnamomum longepaniculatum tissue

表3 不同表面消毒方式的消毒效果Table 3 Disinfection effect of different surface disinfection methods

不同浓度次氯酸钠不同消毒时间对油樟组织根、茎、叶的表面消毒效果如表4、5、6 所示. 试验表明，根、茎、叶消毒效果分别以“GXDF11”“JXDF5”“YXDF4”最佳，即“以5%次氯酸钠震荡洗涤5 min”处理油樟根效果最佳，“以4%次氯酸钠震荡洗涤5min”处理油樟茎效果最，“以4%次氯酸钠震荡洗涤4 min”处理油樟叶效果最佳.

表4 不同浓度次氯酸钠对根处理不同时间的表面消毒效果Table 4 Surface disinfection effect of root treated with different concentrations of sodium hypochlorite at different times

表5 不同浓度次氯酸钠对茎处理不同时间的表面消毒效果Table 5 Surface disinfection effect of stem treated with different concentrations of sodium hypochlorite at different times

表6 不同浓度次氯酸钠对叶处理不同时间的表面消毒效果Table 6 Surface disinfection effect of leaf treated with different concentrations of sodium hypochlorite at different times

2.2 培养基的筛选

以夏季油樟样本为材料筛选内生真菌培养基的结果如表7 所示，结果表明：马铃薯葡萄糖琼脂培养基的分离效果最佳，麦芽浸粉琼脂培养基与卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基也具有良好的培养能力.

表7 夏季油樟组织内生真菌在8种培养基上的培养结果Table 7 Culture results of Endophytic Fungi from summer Cinnamomum longepaniculatum tissue in eight media

以筛选出的马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦芽浸粉琼脂培养基、卵磷脂吐温-80 营养琼脂培养基再对春、秋、冬三个季节的油樟组织进行内生真菌培养，不同季节油樟组织在三种培养基上培养的内生真菌的总菌落数与种数见图1 和图2. 由图可知，总体上，马铃薯葡萄糖琼脂培养基优于麦芽浸粉琼脂培养基与卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基.

图1 不同季节油樟组织在3种培养基上培养的内生真菌总菌落数Fig.1 Total colonies of endophytic fungi cultured on Cinnamomum longepaniculatum tissue in different seasons from three media

图2 不同季节油樟组织在三种培养基上培养的内生真菌种数Fig.2 Number of endophytic fungi cultured on Cinnamomum longepaniculatum tissue in different seasons from three media

3 讨论

在分离植物内生真菌时，表面消毒条件是最关键因素之一，如果表面消毒条件掌握不当，会导致杂菌污染或部分内生真菌被杀死. 表面消毒方法的选择直接影响样本内生真菌的分离效果、样本表面消毒是否彻底、样本是否褐化，还可能影响油樟组织内生真菌生长. 要确保样本表面消毒效果以及保护内生真菌不受损伤，选择合适的表面消毒剂、确定合适的消毒方式且设定适宜的消毒剂浓度以及消毒时间尤其重要[11].本文以油樟根、茎、叶为材料，全面分析了油樟各组织的表面消毒方法，发现油樟根、茎、叶的消毒效果分别以“GXDF11”“JXDF5”“YXDF4”最佳，即“以95%酒精浸泡清洗材料1 min，5%次氯酸钠震荡洗涤5 min，再95%酒精浸泡清洗材料1 min处理油樟根；以95%酒精浸泡清洗材料1 min，4%次氯酸钠震荡洗涤5 min，再95%酒精浸泡清洗材料1 min 处理油樟茎；以95%酒精浸泡清洗材料1 min，4%次氯酸钠震荡洗涤4 min，再95%酒精浸泡清洗材料1 min 处理油樟叶”后无污染，分离的内生真菌种类与数量最多. 这表明采用不同消毒剂与不同的消毒时间对油樟不同组织表面消毒的效果都有影响，对不同的油樟组织采用不同的表面消毒方式能更好的保证油樟组织的内生真菌分离效果，该结果与李军勤[10]研究南方红豆杉内生真菌分离时的表面消毒方法，并发现消毒剂的处理时间对于从植株不同组织器官分离内生菌非常关键的结果一致. 对油樟的根、茎、叶表面消毒时所用的次氯酸钠浓度及时间不一，这可能与组织的密度、组织厚度以及表面结构相关. 该研究结果可为研究不同样本表面消毒提供参考依据.

培养基是给所培养微生物提供生长所必须的营养与环境条件，不同种类的培养基其营养物质的浓度与配比以及pH条件不同，因此选择最适宜的培养基对从功能丰富的油樟中分离出更多的内生真菌、研究其多样性以及筛选出功能特异的内生真菌具有重要研究意义与应用价值. 王娜[12]在分析4 种培养基对人参内生真菌的培养情况后发现PDMA 培养基最适，表明选择正确的培养基对实验结果尤其重要. 目前关于油樟内生真菌分离培养的最适培养基筛选未见报道. 本文通过选择6 种最常见的真菌培养基与两种特色培养基分离培养四季油樟组织的内生真菌，对比分离的内生真菌总菌落数与菌种数，结果显示马铃薯葡萄糖琼脂培养基为分离油樟内生真菌的最优培养基，其次为麦芽浸粉琼脂培养基与卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基.从结果还可看出，春季油樟组织的内生真菌种数最多，而夏季油樟组织内生真菌种数最低，这可能与温湿度有关，可能油樟组织中生长的内生真菌为低温性菌种. 这一结果可为研究油樟内生真菌的多样性与功能提供支撑与基础.