大同黄花菜幼叶诱导再生组织培养初探

沈日敏 卢 瑶 李小玉 邢宝龙

（山西农业大学高寒区作物研究所/大同黄花产业发展研究院 山西大同 037000）

黄花菜（Hemerocallis citrina Baroni），别名萱草、忘忧草、金针菜等，属百合科萱草属多年生宿根草本植物，起源于欧洲及亚洲的温带地区[1]。我国种植黄花菜已有2 000多年之久，分布于全国多个地区，其中甘肃庆阳、湖南祁东、陕西大荔、山西大同、江苏宿迁和浙江缙云形成了我国黄花菜的六大主产区[2]。黄花菜花色鲜亮，不仅可作为观赏花卉，还因其味道鲜美、营养丰富，具有清热利湿、抗菌消炎、抗癌、抗氧化和抗抑郁等功效，深受广大消费者青睐，极具深度开发的前景和市场价值[3]。

大同素有“黄花之乡”的美誉，开始种植并食用黄花菜距今已有600多年。近几年来，在国家及政府的鼓励和扶持下，大同市黄花产业得到了空前发展，涌现出一批优秀的集种植、加工、生产和销售于一体的黄花菜龙头企业，带动当地百姓致富，在大同市推动乡村振兴中发挥了举足轻重的作用。云州区为大同黄花菜的主产区，该区地处火山群下，土层深厚肥沃、疏松透气、日照时间长、昼夜温差大，有利于植物的光合作用和碳水化合物的积累。加之丰富的地下水资源，即使年平均降雨量少，也能保障黄花菜的正常生长需求。得天独厚的地理优势和自然资源造就了大同黄花菜出众的品质[4-5]。大同黄花菜相比其他产区的黄花菜无论是外观品质、营养品质还是食用品质均有其优势：一是花蕾长且多，线条粗壮，肉质肥厚，单蕾长12～15 cm，鲜重3.5～5.5 g，制干后色泽金黄，达到了上乘黄花菜的标准；二是干净无菌，绿色天然，含糖量高，云州区是典型的农业经济区，也是黄花菜的黄金产区，这里种植的黄花菜脆嫩清口，营养丰富，是名副其实的富硒黄花和天然有机食品；三是耐贮性好，制干脱水后的大同黄花菜在干燥阴凉处可放一年不变色[6]。此外，研究发现大同黄花菜的纤维素含量和可溶性蛋白含量均高于全国其他主产区生产的黄花菜[7]。

黄花菜的繁殖方式主要有分株繁殖、切片育苗繁殖和扦插繁殖，但这些繁殖方式存在种苗成本高、生长周期长、繁殖系数小、耗时费力、易带病虫害等弊端，且随传代次数的增加易出现不同程度的品种退化，严重影响黄花的品质、产量和观赏性[8-9]。由于黄花菜为异花授粉植物，基因型杂合且存在一定的败育现象，若直接采用种子繁殖的方法，无论是自交还是异交，其后代极易产生性状分离，难以维持品种的优良性状。由此可见，传统的繁殖方式很难迎合黄花菜种苗规模化种植生产的需求，限制了黄花菜产业的快速发展。而通过植物组织培养的方式既能缩短种苗的繁殖周期、增加繁殖系数，又能保持品种的优良性状、降低变异概率，为引种、实现工厂化育苗和扩大黄花的种植规模打下基础[10]。基于此，已有一些学者以不同产地黄花菜为材料，选取根状茎、花瓣、花药、花梗、花茎、叶片等不同部位作为外植体，探索了黄花菜组织培养繁育体系，为利用该技术进行黄花菜的快速繁育提供了宝贵的经验[11-14]。综合不同学者的研究结果得出，若用黄花菜的花器或者根状茎作为外植体，虽然诱导效果较好，但存在季节限制，难以实现种苗的持续性生产，而以叶片作为外植体，取材容易，诱导效率高[15]。此外，黄花菜的组织培养存在基因型效应，不同品种间由于基因型的差异对培养条件的反应也不同。本试验以大同黄花菜为材料，取植株幼叶作为外植体，研究了一种黄花菜组织培养的再生系统，以期为快速繁殖、引种和种质保存提供理论依据和方法，为大同市黄花产业的种苗工厂化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以田间刚发芽的大同黄花菜幼苗作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的选择与灭菌3月底到4月初，从田间挖出越冬后刚发芽的健康、无病、无虫斑的大同黄花菜幼苗，剪去老根［图1（A）、图1（B）］，切除短缩茎上多余的侧芽块和隐芽块，并剥去顶芽上最外层的叶片，用洗洁精清洗后在流水下冲洗2～3 h，选取淡黄绿色的幼叶进行灭菌处理［图1（C）］，在超净台上用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2灭菌8 min，无菌水洗5～6次，将灭菌后的叶片置于滤纸上吸干多余的水分，然后切成约1.0 cm×0.5 cm大小，叶片背面朝上接种于诱导培养基中［图1（D）］。置于黑暗条件下培养，控制温度（23±2）℃，记录15 d后外植体启动率、污染率和死亡率。

图1 黄花菜外植体消毒过程

启动率=表现皱缩加厚的外植体数/接种的总外植体数×100%。

污染率=被污染的外植体数/接种的总外植体数×100%。

死亡率=非因污染造成的死亡外植体数/接种的总外植体数×100%。

1.2.2 植物激素对幼叶外植体出愈率的影响以MS（易生组培）为基本培养基，调pH至5.8～6.2，加入植物激素配制成不同激素浓度的培养基，121℃高压蒸汽灭菌20 min，在超净工作台中将未冷却的培养基分装于一次性90 mm培养皿中，每皿20 mL，待培养基凝固后每皿接种6片幼叶外植体，每个处理接种10皿，黑暗条件下培养，温度（23±2）℃，分别在15 d和35 d观察启动率（叶片卷曲皱缩）和出愈率（外植体膨大并形成细胞团）。

1.2.3 愈伤组织的分化培养取健康无污染的愈伤组织切成1 cm3的小块，接种于MS添加2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA的分化培养基中，光照度2 000～3 000 lx，光照时间12 h，30 d后观察并统计结果。

1.2.4 生根培养待幼苗长至3～4 cm时转接到普通的MS（含糖和琼脂）培养基上，21 d后观察并统计生根情况，当根长达到5～7 cm时移栽到蛭石、营养土比例为1∶1的基质中。

2 结果与分析

2.1 植物激素对黄花菜幼叶愈伤诱导的影响

由表1可知，本研究借鉴了前人试验中的黄花幼叶诱导愈伤的最佳植物激素浓度，用于筛选诱导愈伤的最佳培养基，结果表明，2,4-D浓度为2 mg/L时、6-BA浓度在0.1～0.5 mg/L之间均可诱导外植体启动和愈伤形成，而15 mg/L的6-BA和10 mg/L的Kinetin都会导致黄花菜叶片变黄枯死，表明高浓度的6-BA和Kinetin不适用于大同黄花菜幼叶的愈伤诱导。

表1 黄花菜幼叶愈伤诱导培养基的筛选

2.2 植物激素浓度对幼叶外植体诱导的影响

在筛选外植体愈伤组织诱导培养基的同时，统计了幼叶诱导的启动率和出愈率。由表2可知，在2,4-D浓度为2 mg/L、6-BA浓度为0.1～0.5 mg/L时，各处理幼叶外植体的启动率分别为58%、40%和64%，出愈率分别为41.67%、23.81%和35.90%，其中0.25 mg/L 6-BA诱导幼叶外植体的启动率和出愈率低于0.1 mg/L和0.5 mg/L的6-BA，而0.1 mg/L和0.5 mg/L 6-BA处理的结果差异不大。但在2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA的培养基上，有些外植体启动之后会出现只膨大而不产生愈伤的情况［图2（A）］，或者即使产生愈伤后期也不再分化茎尖［图2（B）］，有些甚至跳过前面2个阶段直接诱导出根［图2（C）、图2（D）］。因此在诱导黄花幼叶形成愈伤时，2 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA是大同黄花菜幼叶外植体愈伤诱导的最佳培养基。

表2 不同激素浓度对幼叶外植体愈伤组织诱导率的影响

图2 幼叶外植体愈伤诱导的几种情况

2.3 愈伤组织的分化和生根培养及移栽

本试验采用的是王静等[15]给出的最佳分化培养基MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA，统计得出分化率达到65%，平均每块愈伤组织不定芽个数为1.48。生根培养基为普通添加蔗糖和琼脂的MS培养基，接种到生根培养基21 d后，观察到平均每个芽苗生根数为3.21，根长达到5～7 cm时，组培苗移栽后成活率达到85.42%。愈伤组织诱导及分化的流程见图3。

图3 黄花菜幼叶外植体愈伤分化及生根移栽过程

3 讨论与结论

大同黄花菜在生产中存在品种单一、繁殖速度慢、种植规模较小等问题，导致其在国内六大黄花菜产区中知名度和市场竞争力都较差[16]。目前，大同黄花菜种苗的繁殖方法主要以分生繁殖为主，这种方法虽然简便，但受制于母株的生长年限、环境条件及当地的气候，从而导致繁殖系数低、周期长，影响种苗的更新换代和植株的生长发育[17-18]。与传统的繁殖方式相比，植物组织培养不受季节和气候限制，生长周期短，繁殖速度快，方便种苗的规模化生产、标准化管理和自动化控制[19]。为加快大同黄花菜的繁殖速度，扩大种植规模，需要建立快速高效的组织培养技术为其产业化生产提供种苗。本研究采用了易于获取的黄花菜幼叶，通过愈伤组织培养获得组培苗，经炼苗后移栽到温室。这种方法获得的黄花菜种苗不携带病菌，为生产健康的黄花菜产品提供了保障。

本研究利用组织培养3个月就可获得组培苗，极大地缩短了育苗时间。但大同黄花菜幼叶的出愈率远低于王静等[15]的试验结果（86.67%），推测原因可能是由于植物激素在灭菌前添加，导致灭菌后植物激素浓度发生变化，对诱导愈伤产生影响，也可能是选取的叶片不够幼嫩，从而导致出愈率偏低，因此在愈伤诱导过程中尽量选取靠近生长点外3～4层的叶片。在愈伤诱导过程中，2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA培养基诱导的叶片有不正常情况出现，这是因为植物愈伤组织的诱导主要受外植体本身、培养基和培养环境三大因素的调控。同种植物相同外植体在相同培养环境下，若培养基中激素浓度在灭菌前后发生变化，就会导致诱导情况的不确定性，造成生根情况的原因还需进一步研究探讨。本试验所用的生根培养基为不添加植物激素的MS培养基，生根率可达94.33%，与苏承刚等[13]所指出的不添加NAA的生根培养基效果相同。此外，我们还采用短缩茎作为外植体进行了诱导，可以获得愈伤和不定芽，但愈伤繁殖3次后全部出现污染，经多次重复试验，证明短缩茎外植体携带的病原菌难以去除，不适用于作为愈伤诱导的外植体。

本研究以大同黄花菜幼叶为试验材料，成功探索出适用于当地黄花菜品种组织培养的方法，且最终得到了健康的黄花种苗。同时本研究的试验条件要求比较简单，方法可行易于操作，为推广大同黄花菜产业化发展奠定了基础。