天麻素对脑缺血致心肌损伤及NGF/TrkA表达的影响

产翠翠，范心雨，龚鑫

(皖南医学院人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

近年来，随着人口老龄化及饮食习惯的改变，脑血管疾病成为常见病、多发病，缺血性脑卒中的发病率也呈逐年上升趋势。临床数据表明，缺血性脑损伤患者往往并发其他器官功能障碍，甚至衰竭[1]。“脑心综合征”在临床上较为常见，即颅脑疾病并发心脏损害，如心肌损伤、心力衰竭等，会显著提高患者的死亡率[2]。而缺血性脑卒中所致的心肌损伤临床治疗规范性不足，因此迫切需要寻找安全有效的治疗药物。目前认为脑缺血致心肌损伤机制可能与免疫反应有关，脑缺血后通过炎症级联反应引起全身性的炎症[3]。心肌细胞往往受累，抗炎治疗可以减轻心肌损伤[4]。天麻素(gastrodin)分离提取自中药天麻，被广泛应用于心脑血管疾病的治疗，其抗炎活性可以有效减少心肌细胞凋亡[5]。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族的一种分泌型糖蛋白，可以调节神经元的生长、发育、存活和再生[6]，这种调节作用主要是通过结合高亲和力酪氨酸激酶 A(tropomyosin-related kinase A，TrkA)受体产生生物学效应来实现的[7]。NGF/TrkA可表达于心肌细胞中，并且参与心肌梗塞后心肌细胞的损伤修复[8]，同时还参与机体的免疫调节[9]。因此天麻素是否可以通过调节NGF/TrkA缓解脑缺血所致的心肌损伤还有待进一步明确。本研究通过大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)法制备脑缺血大鼠模型，探讨天麻素和NGF/TrkA对脑缺血后心肌损伤的保护机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 成年SPF级雄性SD大鼠，体重200～230 g，购买于青龙山动物实验中心[合格证号：SCXK(浙)2019-0002]。遵照中华人民共和国科技部颁布的2006年版《关于善待实验动物的指导性意见》及伦理学规定完成实验中对大鼠的各种处理。

1.2 主要药物与试剂 天麻素注射液(天辽，规格：5 ml：500 mg，西南药业股份有限公司)，SABC免疫组化试剂盒、苏木精-伊红(hematoxylin-esion，HE) 染色试剂盒、大鼠NGF抗体、大鼠TrkA抗体均购于武汉博士德生物工程有限公司(货号分别为：SA1022、AR1180、BM4100、BA0404)，大鼠TNF-α和IL-10 ELISA检测试剂盒均购于苏州卡尔文生物科技有限公司(货号分别为：CK-E30635R、CK-E30651R)。

1.3 主要仪器 MCAO线栓(型号：2432A2，北京西浓科技有限公司)，石蜡切片机(德国Leica公司)，Western blot相关仪器(美国 Bio-Rad公司)，生物显微镜(型号：BX51，日本OLYMPUS公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 实验分组 40只SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为4组：正常组(Norm组)、假手术组(Sham组)、模型组(MCAO组)和天麻素组(Gas组)，每组10只。

1.4.2 模型制备 应用MCAO法制备右侧局灶性脑缺血大鼠模型，隔夜禁食的大鼠用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，整个实验过程使大鼠肛温保持在(37±1) ℃，在颈部作一中线切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈内动脉的近心端，将线栓由颈内动脉插入约17.5～18.5 mm至阻力出现，确保线栓到达大脑中动脉起始处后结扎线栓。假手术组仅暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不结扎颈内动脉，不插线栓。结束手术后，将大鼠置于适宜温度，待其完全苏醒，对其神经功能状态进行评估。如果大鼠出现左侧肢体瘫痪、无法站立、提起尾巴向一侧转圈等症状，则表示造模成功。

1.4.3 干预方法 造模成功1 d后，Gas组腹腔注射天麻素注射液[10 mg/(kg·d-1)]，干预14 d。Sham组和MCAO组不进行干预。

1.5 标本采集与检测 干预结束后，每组大鼠取半数进行戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，取股动脉血，室温自然凝固离心后(3000 r/min，10 min)，收集上清液，用于ELISA检测。采血完成后断头处死，取出心脏，摘取出左心室，分成两等份，一份用4%多聚甲醛固定，24 h后用于HE染色；另一份装入冻存管，放入-80 ℃冰箱保存，用于 Western blot 检测。每组另半数大鼠麻醉后将其固定于仰卧位，经左心室用4%多聚甲醛和0.9% NaCl溶液先慢后快依次进行灌注，取出心脏，将左心室置于4%多聚甲醛固定液中，石蜡包埋后，用于免疫组织化学染色。

1.5.1 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 依次将标本、标准品和HRP标记的检测抗体加入预先包被TNF-α、IL-10抗体的包被微孔中，再进行温育和洗涤。最后放入酶标仪中，选择450 nm 波长，测定吸光度(OD 值)，计算出最终样品浓度。

1.5.2 HE染色 左心室心肌组织块经4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋组织，切片后进行HE染色，光镜下观察各组大鼠心肌病理学改变。

1.5.3 免疫组织化学(IHC)染色 固定后的左心室心肌组织经石蜡包埋后切片、脱蜡，用热修复法进行抗原修复，再用山羊血清封闭液进行封闭，滴加一抗(NGF 1∶50，TrkA 1∶100)， 4 ℃冰箱中保存过夜，滴加二抗，再滴加 SABC，再用DAB 染色，最后脱水、透明并封片。

1.5.4 Western blot (WB)检测 首先将大鼠左心室心肌组织进行裂解，再研磨离心后取上清液，用BCA 法测定蛋白浓度。配10%的分离胶、5%的浓缩胶，上样、电泳、转膜，常温下用5%脱脂牛奶封闭，4℃冰箱中孵育一抗(NGF 1∶1000、TrkA 1∶1000、GAPDH 1∶1000)过夜，孵育二抗后曝光，最后用软件测量并计算出蛋白相对含量。

2 结果

2.1 天麻素对大鼠心肌组织病理形态的影响 各组大鼠心肌组织HE染色结果如图1所示，正常组和假手术组心肌纤维排列有序，心肌细胞胞质均匀丰富、间隙正常，炎性细胞浸润较少；模型组心肌纤维断裂明显，胞质深染，细胞间隙增大，有大量炎性细胞浸润；天麻素治疗组心肌纤维较模型组排列整齐，细胞间隙减小，炎性细胞浸润减少。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态 (HE 染色，×200)

2.2 天麻素对大鼠动脉血清中炎症因子含量的影响 ELISA检测各组大鼠动脉血清炎症因子TNF-α的含量，结果如图2A所示，与正常组和假手术组相比，模型组大鼠TNF-α的浓度明显增高(P<0.01)。与模型组相比，天麻素治疗组则可以明显抑制TNF-α的升高(P<0.01)。ELISA检测各组大鼠动脉血清炎症因子IL-10的含量，结果如图2B所示，与正常组和假手术组相比，模型组大鼠IL-10浓度未见明显增高，差异无统计学意义(P>0.05)，而天麻素治疗组大鼠IL-10浓度有较大程度的增高(P<0.01)。

A：TNF-α的含量；B：IL-10的含量(n=5) ；与Norm组和Sham组相比，**P<0.01；与MCAO组相比，##P<0.01。

2.3 免疫组化法观察天麻素对大鼠心肌组织中NGF与TrkA表达的影响 免疫组化染色检测各组大鼠心肌组织NGF和TrkA免疫阳性细胞的表达，结果如图3A所示。与正常组和假手术组相比，模型组和天麻素治疗组阳性细胞表达量均增高(P<0.01)，见图3B、图3C。与模型组相比，天麻素治疗组阳性细胞表达量进一步增高(P<0.01)，见图3B、图3C。

2.4 Western blot 观察天麻素对大鼠心肌组织NGF与TrkA蛋白表达的影响 Western blot 检测各组大鼠心肌组织NGF和TrkA蛋白的表达，结果如图4所示。与正常组和假手术组相比，模型组(P<0.05)和天麻素治疗组(P<0.01)大鼠心肌组织NGF与TrkA的蛋白表达均增加；与模型组相比，天麻素治疗组大鼠心肌组织NGF(P<0.05)与TrkA(P<0.01)蛋白表达均进一步增加。

A：Western blot 检测NGF和TrkA蛋白表达情况；B：NGF蛋白相对表达量；C：TrkA蛋白相对表达量(n=5)；与Norm组和Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与MCAO组相比，#P<0.05，##P<0.01。

A：免疫组化检测NGF和TrkA的表达情况(×400)；B：NGF的平均光密度值；C：TrkA的平均光密度值(n=5)；与Norm组和Sham组相比，**P<0.01；与MCAO组相比，##P<0.01。

3 讨论

心肌损伤是缺血性脑卒中患者最严重的并发症之一，这一并发症的发生使得脑卒中患者死亡率大大增加，而缺血性脑卒中致心肌损伤与机体的免疫炎症反应有关[3]，近期研究表明抑制机体炎症反应过程可以有效减轻心肌损伤程度[4]。天麻素是中药天麻的提取物，具有抗炎和抗氧化作用，可以减轻小鼠脑缺血损伤[10-11]及过氧化氢诱导的神经元损伤[12]；可以通过调节Wnt/β-catenin 信号通路抑制小胶质细胞增殖和炎症反应[13]；可以通过上调 MiR-103减轻内毒素诱导的MRC-5细胞炎症损伤[14]；天麻素还可通过激活PI3K/Akt途径、抑制核因子κB(NF-κB)和MAPKs通路活性保护脂多糖诱导H9c2心肌细胞的炎性损伤[5]。

炎症细胞因子包括促炎和抗炎细胞因子，其中TNF-α是主要的促炎细胞因子之一，其与脑缺血致心肌损伤的发病过程密切相关，可引起心肌细胞的凋亡[15]；IL-10是关键的抗炎细胞因子，在抑制炎症反应中起重要作用。研究表明，钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ可以通过调控IL-10的表达水平来减轻脂多糖诱导的心肌细胞损伤[16]。在本研究中发现天麻素对大鼠动脉血清中TNF-α的产生具有抑制作用，而对IL-10的产生具有明显促进作用。与此同时HE染色检测大鼠心肌组织病理形态，显示模型组出现了心肌纤维断裂，心肌细胞胞质深染，且有炎性细胞浸润；而天麻素治疗组大鼠心肌组织纤维断裂得到部分修复，炎性细胞浸润也大大减少。以上结果提示天麻素可以通过上调血液中抗炎细胞因子IL-10的浓度、下调促炎细胞因子TNF-α的浓度而发挥抗炎作用，从而保护脑缺血后受损伤的心肌细胞。

NGF不仅与神经元的生长有关，还与心肌组织中血管生成和细胞的存活有关[8]，甚至可以作为重要媒介参与神经系统、内分泌系统和免疫系统的相互调节[9]。研究表明实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠NGF水平的上调，可使脑组织炎性细胞浸润减少，神经损害得到有效控制[17-18]。因此NGF在炎症性疾病中可以发挥重要的抗炎作用，这与其对炎症因子的调节密切相关。NGF与其功能性受体TrkA结合后可以抑制NF-κB通路的活性，使促炎细胞因子TNF-α产生减少[19]；促进PI3K/Akt途径的活性，使抗炎细胞因子IL-10产生增加[20]。这与本研究中天麻素治疗组结果一致，免疫组化染色及Western Blot实验均显示天麻素治疗组大鼠NGF与TrkA表达水平均上升，ELISA检测显示血TNF-α减少，IL-10升高，因此天麻素对炎性因子的调节可能是通过上调NGF/TrkA的水平来实现的。

本研究还发现模型组大鼠虽然NGF与TrkA表达水平上升，但相较于天麻素治疗组大鼠上升程度较低，且血液中炎性因子的变化与之相反，即TNF-α水平较高、IL-10水平较低，炎症反应更明显，心肌损伤也较严重。说明NGF与TrkA表达量不同，对体内炎症细胞因子的调节作用也不同，进而影响心肌炎症性损伤的修复效果。研究表明，NGF的表达量与IL-10的水平存在正向相关关系，NGF剂量越大，越能上调IL-10的水平[21]。因此推测模型组NGF与TrkA的上调可能是机体的内源性保护机制，但由于上调的剂量不足，使得抗炎细胞因子IL-10升高水平不够，未能抑制机体的炎症反应。而天麻素治疗组较大程度地上调了NGF/TrkA的剂量，使得IL-10的水平明显升高，同时TNF-α水平下降，从而对脑缺血后心肌组织的炎性损伤进行保护。

综上所述，天麻素可以修复脑缺血所致的炎症性心肌损伤，可能与调节大鼠心肌组织中NGF/TrkA的表达、血清中TNF-α和IL-10的水平有关，这为缺血性脑卒中患者心肌损伤的临床治疗提供了一定思路。