线性钆沉积大鼠模型使用大环钆剂后脑内钆沉积的变化研究

王旭聪，李健，张睿，王振华，摆玉财，马耀兴，陈兵

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)增强检查已成为临床重要的影像学检查方法之一。目前最常用于MRI增强检查的对比剂为钆对比剂(gadolinium-based contrast agent，GBCAs)[1-3]。一直以来，GBCAs被认为是一种相对安全的对比剂。近年来多项人类和动物实验研究表明，多次重复给予线性GBCAs后，小脑深部核团(deep cerebellar nuclei，DCN)T1WI呈现高信号并出现器官钆沉积[4-9]，给予不同类型的GBCAs后，脑组织中钆沉积存在显著差异[6-7,10]，注射大环型GBCAs的大鼠DCN T1WI图像未见明显增高信号且脑内钆浓度明显较低[11]。MR图像解读主要依靠不同组织信号强度的对比，常规MR图像的信号强度会受到扫描设备和参数的影响，难以与正常参考值比较。与常规 MRI相比，多对比度的定量磁共振成像MAGIC序列实现了MR图像从常规灰阶图到组织定量图谱的转变, 一次扫描可以得到纯粹的T1及其它弛豫时间定量化数据，为临床提供更多有价值的诊断信息。

目前关于接受线性GBCAs之后再接受大环型GBCAs的钆沉积报道较少，本研究动物模型为前瞻性评估已建立线性钆沉积模型的大鼠在之后连续多次使用线性GBCAs(钆双胺)及大环型GBCAs(钆特酸葡胺与钆布醇)DCN T1弛豫值的变化，以DCN钆浓度的测定以及小脑HE染色切片为金标准，并与传统的MRI信号强度比值作比较，探究在已出现线性钆沉积的大鼠中继续注射大环型钆对比剂后大鼠脑内钆沉积的变化。为临床上已经出现脑部线性钆沉积的患者选择GBCAs提供参考依据，并且尽可能排除混杂因素，规范钆沉积的研究。

材料与方法

1.钆沉积大鼠模型的建立

本实验已通过宁夏医科大学实验动物伦理学要求。选取28只体重为(210±29)g的健康雄性Sprague-Dawley大鼠(动物生产许可证号SCXK [宁]2009-0001), 在正常条件下进行饲养。在首次注射前及每周注射后对大鼠进行头部MRI扫描，并测量大鼠DCN T1值及DCN/小脑皮质T1WI信号比值。首先对所有大鼠在全麻下(3%～3.5%异氟烷)进行尾静脉注射钆双胺注射液 (GE healthcare)20次(4次/周，共5周；单次剂量均为0.06 mmol/kg)建立线性钆沉积模型，5周后处死5只大鼠进行电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)实验测定DCN钆浓度，并进行小脑组织苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)组织学分析。将剩下的大鼠随机分为四组：①钆布醇(大环型GBCAs)组：注射钆布醇注射液(瑞威尔生物科技有限公司 )；②钆特酸葡胺(大环型GBCAs)组：注射钆特酸葡胺注射液 (江苏佳迪显医药股份有限公司)；③钆双胺(线性GBCAs)组：注射钆双胺；④高渗盐水(对照)组：注射高渗盐水(1350 mOsm/kg，渗透压与钆对比剂接近)。注射次数及剂量与之前相当。最后一次MRI扫描完成后立刻对大鼠安乐死进行ICP-MS实验测定DCN钆浓度以及HE染色组织学观察分析(图1)。

图1 注射和MRI方案结果。钆双胺每周注射单次剂量0.06 mmol/kg，共4次，共5周。分组后各组注射次数及剂量与之前相当。

图2 a)大鼠脑解剖：小脑深部核团(DCN)和齿状核的定位(选自《大鼠脑立体定位图谱》第64图[12])；b)大鼠MRI T1WI图像：DCN和齿状核的定位，DCN用于定量分析的ROI定位；c)大鼠SynMRI 图像：DCN和齿状核的定位，DCN用于定量分析的ROI定位。图3 a)大鼠脑解剖：小脑深部核团(DCN)与邻近小脑皮质的定位(选自《大鼠脑立体定位图谱》第64图[12])；b)大鼠MRI T1WI图像：小脑深部核团(DCN)与邻近小脑皮质的定位，计算ROI DCN/小脑皮质T1WI信号比值。

2.MRI扫描及图像分析

大鼠经异氟烷吸入麻醉后，选取俯卧位固定于大鼠8通道脑专用线圈(上海辰光医疗科技有限公司)，采用3.0T MR仪(GE SIGNA Architect)对大鼠脑部进行扫描，行T1WI FSE序列(TR 470 ms，TE 10 ms)、T2WI FSE序列(TR 2500 ms，TE 85 ms)及MAGIC序列横轴面扫描，各序列采集12层，层厚2 mm，间距0.2 mm，矩阵128×128，FOV 8.0 mm×8.0 mm。所有图像分析均在盲法和随机条件下进行，由两名放射科医师(分别从事MRI临床应用和研究10年和5年)对图像进行定量分析，采用机器自带可自动生成伪彩图的后处理软件SynMRI(版本100.0.0)进行图像分析和数据测量，在左右两侧DCN实质上勾画兴趣区(ROI)，见图2，左右两侧取平均值，记录T1时间弛豫值；分别在左右两侧DCN及小脑皮质实质上勾画ROI(图3)，左右两侧取平均值，计算DCN/小脑皮质T1WI信号比值。

3.DCN钆浓度测定

在异氟醚麻醉下通过放血对大鼠实施安乐死。将大鼠的小脑整块提取并半切，一半用于ICP-MS定量分析 ，一半用于后续HE染色切片制作，由质谱分析工作人员测定DCN中钆浓度，结果以每克湿组织重量(组织样品)的Gd含量(ug/g)表示。

4.组织学检查

根据大鼠脑部解剖图谱，在冰浴中迅速切取包含DCN冠状切片，由病理科工作人员在37℃恒温下染色5 min，将染色组织拍照后置于10%甲醛溶液固定1周，切片后HE染色显微镜下观察。

5.统计分析

大鼠DCN T1弛豫时间与DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值分析采用双方差分析(ANOVA)检测各组间各时间点的差异。在检验正态分布后，采用Kruskal-Wallis检验小脑组织钆浓度的差异。采用Spearman相关系数评估大鼠DCN T1值与DCN/小脑皮质T1WI信号比值以及DCN中钆浓度的相关性。数据分析均采用统计学软件IBM SPSS Statistics 25.0。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

28只大鼠中，2只大鼠(W3、W5)死于麻醉并发症， 1只大鼠(W4)死于尾静脉感染。最终25只大鼠完成了实验。

1.MRI扫描

在建立线性钆沉积模型初期，在第3周(累积12次注射后)大鼠T1WI图像显示DCN区域出现显著的高信号，并在之后的第4周与第5周更明显(图4)，DCN T1值呈逐渐下降趋势，DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值逐渐增高。

图4 前5周注射钆双胺后大鼠颅脑T1WI图像，DCN信号在累计12次注射钆双胺后明显增高(箭)，并随着累计注射剂量的增多而呈持续而显著的高信号(箭)。 图5 后5周分组后大鼠颅脑T1WI图像，钆双胺组DCN信号进行性增高(箭)，其它组DCN信号未见明显持续增高。

分组后钆双胺组大鼠T1WI图像显示DCN信号持续及进行性增高，DCN T1值继续呈逐渐下降趋势，DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值逐渐增高。其它组大鼠T1WI图像显示DCN信号未见明显持续增高(图5)，且DCN T1值未见继续下降趋势，DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值未见继续增高(图6)。

图6 a、b)建立线性钆沉积模型前5周大鼠DCN T1值随累积注射次数增加呈逐渐下降趋势；b)建立线性钆沉积模型前5周大鼠DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值随累积注射次数的增加逐渐增高；c)不同分组大鼠DCN T1值随累积注射次数的变化情况，钆双胺组大鼠继续呈逐渐下降趋势，其它组大鼠DCN T1值未见继续下降趋势；d)不同分组大鼠DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值随累积注射次数的变化情况，钆双胺组逐渐增高，其他组未见继续增高。

大鼠DCN T1值与DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值呈显著负相关(r=0.89，P<0.01)。

2.DCN钆浓度测定

钆双胺组大鼠DCN组织中每克组织钆浓度显著高于其它各组(表1)，P<0.05。DCN T1值与DCN组织钆浓度呈显著负相关(r=0.87，P<0.05)。

表1 大鼠DCN末次MRI扫描数据与DCN浓度比较

3.组织学观察

第5周处死的大鼠、钆双胺组、钆特酸葡胺组、钆布醇组、高渗盐水组大鼠DCN区域HE染色切片显示绝大多数神经元结构和形态亦未见明显异常(图7、8)。

图7 大鼠小脑DCN 区域大多数神经元结构和形态亦未见明显异常(HE，×200)。a)第5周处死的大鼠；b)钆双胺组；c)钆特酸葡胺组；d)钆布醇组；e)高渗盐水组。 图8 a)健康大鼠含DCN横轴位层面的HE染色切片全面观；b)对应DCN部位放大显示(×200)。

讨 论

在MRI增强检查中，GBCAs的使用在疾病诊断中具有重要的作用。GBCAs根据结构可分为尾部带有Gd3+离子的线性类及配体内含Gd3+离子的大环类。大环型GBCAs钆布醇及钆特酸葡胺其内的Gd3+被包裹在环状结构其中，线性GBCAs钆双胺中的Gd3+在其尾部未有其它结构包绕。尾部带有Gd3+离子的线性类GBCAs更易释放Gd3+离子。齿状核中的金属成分丰富，这些金属有机化合物与钆剂的交换通过金属间的跨金属现象发生，从而释放出游离的Gd3+离子，引起钆剂在齿状核区域中沉积，从而显示为该区域的低T1弛豫值。在临床常规GBCAs用量为0.1 mmol/kg(0.2 mL/kg)，人体内GBCAs排泄半衰期约为1.2～2 h，GBCAs在健康大鼠的排泄半衰期约0.3 h，明显短于人类GBCAs排泄半衰期(1.2～2 h)，在本次研究中，每周注射4次(间隔24 h)在10周内共给药40次，可减少组织暴露，并支持较短的给药时间间隔。根据FDA关于动物相对于人体的药物剂量换算方案，本次研究大鼠单次GBCAs注射剂量为0.06 mmol/kg，符合剂量标准。

GBCAs是一种渗透负荷较低的高渗溶液，但在临床剂量下生理后果可以忽略不计(除非GBCAs在注射时外渗)，因此本次研究设定高渗盐水组以评估高渗本身是否对MRI信号有任何影响。在后期大鼠分组后5周内GBCAs及高渗盐水注射期间，笔者观察到钆特酸葡胺组与钆布醇组(大环型GBCAs)大鼠以及高渗盐水组大鼠在后期DCN T1值均有持续的上升，但高渗盐水组大鼠上升更快，笔者推测首先GBCAs在人体代谢中随着时间会自然排出部分，其次钆特酸葡胺与钆布醇(大环型GBCAs)的使用也可能使DCN区域T1值降低，但这种降低程度被人体自然代谢所掩盖，因而显示钆特酸葡胺与钆布醇(大环型GBCAs)组大鼠DCN T1值缓慢上升趋势。

本次研究结果在前5周线性钆沉积造模大鼠中，在第3周MRI扫描图像上见T1WI DCN显著高信号，这与既往研究中结果一致[13]；后期分组后线性GBCAs组大鼠DCN信号远远高于大环组及高渗盐水组，笔者推测从线性GBCAs转换为大环型GBCAs的使用后并不会显著增加钆沉积。当前已有ICP-MS结果表明给予不同类型的GBCAs后，脑组织中钆沉积存在显著差异[8]，在本次研究ICP-MS定量分析中，钆双胺组大鼠DCN钆浓度远远高于其它各组，与本次MRI扫描测量分析的结果一致。在本次的研究中笔者通过对大鼠DCN区域HE染色切片分析并未发现相关的脑部病理学损伤出现，同时DCN钆浓度的测定也提示接受线性GBCAs之后再接受大环型GBCAs的安全性相对良好。

定量图谱磁共振成像技术MAGiC序列是基于多个回波多个延迟序列的一种新型MRI集成序列，具有快速扫描、多组成像等特点，通过调整TE、TR及反转时间参数可得到任意对比的图像，以满足不同临床诊断需求。在本研究中，笔者采用定量图谱磁共振成像技术MAGiC序列对大鼠DCN T1值进行量化，并同时采用传统信号强度比值来与其作对比。结果显示大鼠DCN T1值与DCN/小脑皮质T1WI信号强度比值呈显著负相关(r=0.89，P<0.01)，由于钆的顺磁性效应，可缩短T1弛豫时间，增高T1信号强度，这与本研究的结果一致，提示定量磁共振成像技术在大鼠DCN钆沉积定量测量中的可行性。目前许多关于钆沉积的报道是比较同时使用不同类型GBCAs后体内钆沉积的差异，而关于接受线性GBCAs之后再接受大环型GBCAs的相关钆沉积报道较少，本研究前瞻性评估已建立线性钆沉积模型的大鼠在之后连续多次使用不同类型GBCAs后DCN T1值的变化，与传统的MRI信号强度比值作比较显示显著相关性，提示定量磁共振成像技术在大鼠DCN钆沉积定量测量中的可行性及良好应用价值。

本研究还存在一些局限性：①与临床患者所接受GBCAs的剂量相比，本研究中的大鼠受到了更高、更频繁的剂量。在临床患者所接受GBCAs的剂量及常见次数下，从线性GBCAs转换为大环型GBCAs静脉注射后微量元素钆的检测水平预计会大大降低，而且使用通常的人体剂量可能会低于大多数分析仪器的检测限度。还需要进一步研究更低的剂量和更少的使用GBCAs。②虽然在大鼠脑内钆沉积与神经组织病理损伤似乎没有关系，但之后的生理意义和最终的临床意义是未知的。国内外至今仍然没有明确的证据证明GBCAs脑内沉积现象能够引起中枢神经系统或者其他系统的损伤，但是由于GBCAs可以分布在羊水、乳汁中，并且能够透过胎盘，以及钆沉积量与接受GBCAs剂量相关等危险因素存在，仍需要大量研究探索组织中的GBCAs沉积潜在的危害。

综上所述，本研究结果表明，在已出现线性钆沉积的大鼠中，继续使用大环型GBCAs钆特酸葡胺及钆布醇相对一直使用线性GBCAs脑内钆沉积较少，相对较为安全，为临床上已经出现脑内线性钆沉积的患者选择GBCAs提供参考依据。