成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联系统在核酸检测中的应用进展

李宗祥，王金林，王佳芮，罗继全（通信作者）

三诺生物传感股份有限公司 （湖南 长沙 410000）

1987年，Ishino 等[1]在研究大肠杆菌碱性磷酸酶同工转化基因时，意外发现了一种规律性的重复序列，但是当时的科学家并不清楚这种序列的生物学意义。在随后的几年时间里，不同的科研人员发现在不同的古生菌中均存在相似的重复序列[2]。2002年，Jansen 等[3]通过生物信息学分析，发现这种规律的重复的DNA序列只存在于细菌及古生菌中，并将这种串联间隔重复序列正式命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），同时将与 CRISPR 关联密切且能编码超嗜热古生菌特异性DNA修复酶的基因命名CRISPR关联基因（CRISPR-associated proteins，Cas）酶。2005年，多个研究团队的研究结果均表明，CRISPR的间隔序列（Spacers）可能源于染色体或是已存在的噬菌体和质粒[4-6]。Makarova 等[7]根据研究结果推测，CRISPR和Cas酶共同组成一种原核生物特有的免疫防御系统。2007年，Marraffini 和 Sontheimer[8]首次通过实验证实了CRISPR在细菌的免疫功能中起作用。2012年，Gasiunas 等[9]通过嗜热链球菌体外实验表明，CRISPR/Cas9 系统通过切割入侵噬菌体的核酸来抵御侵染，进一步证实了 CRISPR 系统的防疫功能。Cong等[10]利用 CRISPR/Cas9 系统进行了基因编辑的首次尝试，对人和小鼠细胞系的基因实现了定点突变，同年 Mali[11]利用 CRISPR/Cas9 在人293T 细胞和 K652细胞进行基因编辑并取得成功。此后，越来越多的 Cas 酶被发现[12-15]，而随之CRISPR/Cas 系统在基因编辑、体外诊断上的应用也越来越广泛。

1 CRISPR/Cas 系统的分类

CRISPR/Cas 系统根据 Cas 蛋白效应复合物的性质主要分为两大类，1类CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，其中Ⅰ型包括A、B、C、D、E、F和U 7种亚型，Ⅲ型包括A、B、C、D 4种亚型；2类CRISPR/Cas系统包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型，其中Ⅱ型包括A、B、C 3种亚型，Ⅴ型包括A、B和U 3种亚型，Ⅵ型包括A、B、C 3种亚型[16-18]，如图1所示。1类CRISPR/Cas系统发挥作用依赖于3～6个不同的Cas蛋白组成的多蛋白效应复合物，这些蛋白在这种适应性免疫过程中发挥着不同的功能[19]，2类 CRISPR/Cas 系统 Cas 蛋白的种类较少，主要的 Cas 蛋白亚型有Ⅱ型-Cas9、Ⅴ型-Cas12和Ⅵ型-Cas13[20-22]。

图1 CRISPR/Cas 系统分类

2 CRISPR/Cas 系统的作用机制及在核酸检测中的应用

2.1 CRISPR/Cas9 系统

CRISPR/Cas9 是CRISPR/Cas 系统中最早应用于生命科学研究的[10-12]，也是细菌抵抗自然界中噬菌体侵染的一种防御机制。CRISPR/Cas 的作用机制如下（图2）：第一阶段，病原体核酸获取，当外源噬菌体侵染细菌时，细菌体内的 Cas1、Cas2 蛋白能够扫描噬菌体DNA序列，并识别出此段DNA序列上的间隔序列前体临近基序（protospacer adjacent motif，PAM），随后将剪切临近PAM的间隔序列前体（Protospacer）作为新的间隔序列插入到细菌自身的CRISPR中[20]，PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基），根据Cas酶的种类不同而有所差异[21-22]；第二阶段，CRISPR crRNA的合成，CRISPR 会在前导区调控下转录生成前体 crRNA（pre-crRNA）和反式激活 RNA（trans-acting crRNA，tracrRNA），之后，tracrRNA 与 precrRNA碱基互补配对，pre-crRNA 被剪切加工生成成熟 crRNA[23]；第三阶段，噬菌体再次入侵时，成熟的 tracrRNA/crRNA 复合体招募 Cas9 蛋白形成 Cas9/crRNA/tracrRNA 复合体，crRNA 的间隔序列通过与靶标 DNA 序列碱基互补配对将复合体定位到 PAM/原间隔序列的区域，DNA 双链被解开，Cas9 核酸酶剪切这段序列，使外源噬菌体 DNA 表达沉默，从而保护细菌抵御病毒的侵害[24]。

图2 CRISPR/Cas 的作用机制

CRISPR/Cas9 蛋白在引导 RNA（guide RNA，gRNA）的指导下能够切割双链 DNA（double-strand DNA，dsDNA），CRISPR/Cas9 系统除能够在细菌体内通过基因编辑来抵御病毒侵害外，很多研究人员进一步将 CRISPR/Cas9 的这一特性成功有效地应用到体外诊断中。快速有效的即时检验（pointof-care testing，POCT）技术能帮助患者在资源匮乏的环境中进行疾病的早期诊断成为可能，同时还能帮助患者实现疾病的自我监测，如 Pardee 等[25]将其与核酸序列扩增技术（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）和toehold switch传感器相结合以单碱基分辨率检测寨卡病毒；2018年，Huang等[26]开发的 CRISPR/Cas9 触发的等温扩增指数反应（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR）技术通过Cas9 裂解产生的 DNA 片段引发循环扩增反应，通过实时荧光检测实现靶标（DNA和mRNA）灵敏度低至阿摩尔（aM），并能够有效区分单碱基错配。为检测细胞内囊泡衍生的微小 RNA（micro RNA，miRNA），Wang 等[27]结合滚动循环扩增技术（rolling circular amplification，RCA）与 CRISPR/Cas9 建立了 RCA 辅助 CRISPR/Cas9 剪切平台（RCAassisted CRISPR/Cas9 cleavage，RACE），在多种疾病诊断和预后评估发挥着重要作用。Wang等[28]建立的 CRISPR/Cas9 侧向层析核酸检测平台（CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay，CASLFA）1小时内即可完成非洲猪瘟病毒和单核细胞增生李斯特菌等的检测，这种与层析结合的检测方式不受检测环境限制，操作简单，准确度高。除能够检测单基因外，在2021年， Xiong 等[29]开发的新型冠状病毒 CRISPR/Cas9 三线侧向层析核酸检测方法（CRISPR/Cas9-mediated triple-line lateral flow assay，TL-LFA）单试条可实现双基因的检测。

2.2 CRISPR/Cas12 系统

CRISPR/Cas12 系统在体内抵御病毒核酸 DNA的剪切机制与 CRISPR/Cas9 系统类似，但也有不同。CRISPR/Cas9 识别靶标DNA 后对靶标进行切割，但 CRISPR/Cas12 被激活后除能够剪切靶标单链DNA 外，Cas12还具有非特异性切割单链 DNA的酶切活性[18-19]。简而言之，当 Cas12 和 crRNA结合，并识别靶标单链 DNA 序列后，Cas12 的酶切活性被激活，除能够剪切靶标DNA 序列外，还能切割所遇到的其他任何单链DNA，这就是所谓的侧向切割活性。在反应体系中加入标记荧光/淬灭基团的单链报告DNA，就会被Cas12 蛋白切割，释放出荧光信号，这样就可以通过相应仪器检测荧光信号的有无，从而进行诊断结果阴阳性的判读，这就是利用Cas12 蛋白做基因诊断的原理。正是利用这一特性，CRISPR/Cas12 能更适用于体外核酸检测诊断中。

近年来，CRISPR/Cas12 在体外诊断中得到了快速的发展。如 Chen 等[30]将重组聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplificaton，RPA）与CRISPR/Cas12 相结合建立的 DNA 核酸内切酶靶向 CRISPR 反式报告基因方法（DNA endonucleasetargeted CRISPR trans reporter，DETECTR）能够在1小时内实现对临床样本中 HPV16 和 HPV18 的分型检测，特异度达到100%和92%，灵敏度可检测到阿摩尔的 DNA 分子。Li 等[31]基于 CRISPR/Cas12 系统建立的一种单小时低成本多用途高效系统（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system，HOLMES）灵敏度与 DETECTR相当，通过在 PCR 引物中引入 PAM 序列，能够区分 DNA 和 RNA 病毒株，并实现任何单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点的检测，检测流程如图3所示。2019年该团队在现有基础上又进一步建立了HOLMES v2平台，该平台能够检测人的mRNA和环状RNA[32]，实现了对DNA甲基化程度的定量测定。除此之外，与DETECTR 和 HOLMES 等检测平台相比，Dai等[33]开发的以 CRISPR/Cas12a 为基础的电化学生物传感器[a CRISPR-Cas12a（cpf1）based electrochemical biosensor，E-CRISPR]检测成本更低且易携带，与适配体结合可检测临床样本中的一些蛋白。

图3 CRISPR/Cas12诊断检测流程

以CRISPR/Cas12为基础建立的体外检测平台除能够检测核酸DNA 外，通过一定的生物技术手段将靶标RNA 转变为DNA 进而也能实现对靶标RNA 的检测。这个技术在体外检测中的应用对于靶标DNA 甲基化程度检测、DNA 病毒的分型检测以及靶标SNP 位点基因检测具有重要意义。

2.3 CRISPR/Cas13系统

CRISPR-Cas13是 向 导RNA 介 导 的RNA 靶向的内切酶系统，是目前CRISPR-Cas 家族中唯一的一支靶向单链RNA（single stranded RNA，ssRNA）系统，其中CRISPR/Cas13a 是第一个被应用于靶向RNA 切割的效应蛋白。该系统类似于CRISPR/Cas12系统，Cas12靶标为单链DNA，与Cas12不同的是，Cas13蛋白靶标为单链RNA。CRISPR-Cas13应用在体外诊断中的检测原理和Cas12基本一致，只是发光底物由单链DNA 变成了单链RNA。因为CRISPR/Cas13是CRISPR 家族中靶向RNA 的系统，这使得CRISPR/Cas13系统在体外检测靶标RNA 方面发挥着重要的作用。

2017年，Gootenberg 等[34]将Cas13与RPA扩增相结合建立了一种RNA分子的检测方法——高灵敏度的报告基因开锁法（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）；与以CRISPR/Cas12为基础建立起来的检测平台相比，靶标扩增后的转录步骤进一步放大信号，使得检测灵敏度可以进一步提升，如图4所示；为实现多靶标同时检测并摆脱依赖仪器检测荧光的限制，在2018年，该团队对此平台进行优化建立了SHERLOCK v2平台，新平台通过4种不同Cas蛋白实现了4个不同靶标的定量检测，为使检测结果读取更加方便快捷，创新性地与免疫层析胶体金技术进行结合，实现了不依赖仪器直接肉眼判读结果的诊断方式，更好地将 CRISPR/Cas 检测系统应用到POCT中[35]。随之，Myhrvold 等[36]通过加热和化学还原裂解病毒颗粒并灭活体液中高水平核糖核酸酶的方法（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases，HUDSON），进一步实现了对体液中的病毒不需核酸纯化就可直接检测的目的，简化了诊断检测流程，缩短了诊断检测时间，并最终应用到可检测全血、血清和唾液中的寨卡病毒和登革热病毒。优化的 SHERLOCK 平台为更好地提高检测靶标的灵敏度，需要和靶标扩增步骤相结合，而与现有的 PCR 技术相比，CRISPR 技术更大的热点趋势与优势是实现靶标免扩增检测；为更好地实现这一目标，研究人员做了很多的科研实验并取得了一定的研究成果，如 Shan 等[37]建立的miRNA 检测平台可实现在30分钟内完成 miRNA 的免扩增检测，检测限可达4.5 aM；Bruch等[38]结合微流控装置建立的miRNA检测平台使用微量样本（0.9 μL）即可完成检测；2019年 Qin 等[39]开发的自动化微流控检测平台使用便携集成荧光计能够检测相应底物的荧光强度，与便携式仪器结合的检测方式更加适用于野外及设备欠缺地区等。

图4 CRISPR/Cas13诊断检测流程

CRISPR/Cas13系统与扩增技术相结合能够实现对病毒的高灵敏度检测和分型，对传染病预防以及治疗具有重要意义，但仍存在以下局限性：（1）crRNA 筛选工作量大；（2）检测成本较高；（3）脱靶可能性大。对于上述局限性的改变将拓宽CRISPR/Cas 系统的应用。

3 CRISPR/Cas 核酸检测平台比较

CRISPR/Cas 系统利用Cas 蛋白的核酸剪切酶活性对靶标进行检测，在病原体检测、基因分型及疾病治疗上发挥重要作用。目前发现的基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13为基础建立的核酸检测平台如表1所示。

表1 CRISPR/Cas 核酸检测平台

通过比对发现，CRISPR/Cas 系统在体外检测的应用各有不同，各有优势。而为了更好地提高靶标检测的灵敏度及缩短检测时间，目前CRISPR 检测主要是与恒温扩增技术相结合，但是这种结合会使得反应极为迅速且极易达到饱和状态，所以目前技术仍难以达到对靶标的准确定量检测的目标，所以需要进一步对各种条件进行优化。

4 小结

近几年，因为CRISPR/Cas 系统所具有的技术优势在不断的引起科学界的重视，尤其是2019年暴发的新型冠状病毒感染疫情，更是让CRISPR 技术分子诊断方面的应用得到了快速发展，除此之外，CRISPR 技术在人体遗传疾病的治疗与预防、农作物育种、新药开发等方面也扮演着越来越重要的角色。

准确、快速、经济的核酸检测方法在感染性病原体诊断中起着重要的作用。目前，核酸检测金标准是以PCR 为基础的诊断方法，其灵敏度高、特异度高，但需要特殊的仪器、实验检验场地和专业技术人员，且对实验室有严格的分区要求，这些需求限制了PCR 技术在疫情暴发的贫困国家及基础设施缺乏的地方的使用。此外，很多检测手段的发展特别是基于抗体的检测手段，需要一个极长的研发周期，这在面对致命病毒与快速进化的病原体时也有很大不足。由于基于CRISPR 技术的检测系统简单易操作，且极大地降低了对于仪器的依赖，因此基于CRISPR 技术的分子诊断平台未来发展前景可观。

目前，基于CRISPR 技术的体外核酸检测方法处于起步发展阶段，现有诊断方法仍需进一步摸索和改进。如何实现无需扩增靶标序列直接检测、如何进一步提高核酸检测的灵敏度和特异度、如何将试剂组分合并与简化、如何实现基于CRISPR 技术的核酸检测走向家庭化/私密化、如何更进一步地降低成本、如何将CRISPR 检测核酸技术和仪器设备相结合实现自动化快速检测，这些都是基于CRISPR 技术核酸检测需要改进和发展的方向。未来各种具备其他特性的Cas 酶也会被人们发现并加以利用，结合上创新的信号检测手段及其他技术，基于CRISPR 技术为基础的分子诊断将会在时间、成本、灵敏度、体积等多个维度上得到革命性的改变。