人参根腐病离体抗性筛选方法初探

张晶晶，张 宁，侯 微，曲正义，李亚丽，郑培和

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

人参（Panax ginsengC.A.Meyer）是五加科人参属多年生草本植物，具有很高的药用价值和经济价值［1］。早在西汉时期，人参就在治疗和防御疾病等方面被广泛应用［2］。人参药用部位为多年生宿根，生长周期长，易遭受多种病原菌的侵染［3］。人参根腐病是一种土传性真菌病害，是人参根部主要病害之一［4］。该病发病初期症状不明显，后期叶片开始变黄，地下根部腐烂，严重时可导致整株人参死亡，对人参的产量和质量造成很大的影响［5-7］。筛选并培育人参抗根腐病品系是有效且常用的防治病害的方法之一，而抗病品系的发掘和利用是培育抗病品种的重要环节，因此，建立一套准确、实用的人工接种抗病性筛选方法，可以加快人参的抗病育种进程。

邓丽君等［8］研究表明离体叶片接种法可用于甜瓜白粉病生理小种的鉴别和抗源鉴定。朱丽梅等［9］采用自然病圃法和离体叶片接种法分别对茄子早疫病进行抗病性筛选比较，鉴定结果基本一致，说明离体叶片接种法可作为茄子早疫病抗病性筛选的辅助手段。与活体接种筛选相比，离体叶片接种法筛选具有不损伤植株、节省菌液、接种标准一致以及不易产生病原菌扩散等优点［10］，但根腐病离体抗性筛选相关的报道相对较少。有研究表明，在木薯和白掌中可通过离体叶片接种法对根茎部病害进行抗性筛选［11，12］。在百合中，离体叶片接种法可用于鳞茎腐烂病抗性资源筛选，并通过试验表明该方法可靠、有效［13］。

目前，国内外鲜见人参根腐病离体抗性筛选的相关报道。本研究通过人参离体接种方法对人参离体叶片和根块进行根腐病接种，并利用病斑直径及发病情况对人参种质材料进行抗病性评价，为人参根腐病的抗性筛选及资源评价提供新的技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为吉林省吉林市左家镇试验基地（中国农业科学院特产研究所左家资源圃）4年生人参。

1.2 供试菌株

腐皮镰刀菌（Fusarium solani），由中国农业科学院特产研究所分子生物学实验室前期筛选所得。

1.2.1 培养基 固体培养基：称取37 g马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），加入1 000 mL去离子水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15 min，备用。

液体培养基：称取35 g马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB），加热搅拌，溶于1 000 mL去离子水中，分装，115℃，高压灭菌20 min，备用。

1.2.2 菌种培养 活化培养：将带有腐皮镰刀菌菌丝的琼脂块通过无菌手术刀切成0.4～0.5 cm的菌块，接种到PDA培养基的平板上。封口膜封口后，倒置于25℃培养箱中，活化培养2～3 d，至白色菌丝长满培养基表面时取出。

扩大培养：将活化培养的0.4～0.5 cm的菌块，接种到新的PDA培养基，相同条件下培养2～3 d，至白色菌丝长满培养基表面时取出，备用。

将保存的根腐病菌转接到PDB液体培养基中，将其在温度为25℃、转速为200 r/min的摇床上避光摇3 d，使其产生大量的孢子，将含孢子的PDB液体培养基用2层无菌纱布过滤，除去菌丝以获取孢子悬浮液，利用血球计数板在显微镜下将孢子悬浮液的浓度调整为1×106个/mL，用于接种鉴定。

1.2.3 人参离体叶片接种 每株摘取6片完全展开的叶片，采用菌块、孢子悬浮液2种不同的接种方法分别对人参叶片正反面进行接种，每组3次重复，以不接种病菌作为对照，将叶片置于含有吸水滤纸的培养皿中，使用10μL的移液器吸取10μL的孢子悬浮液滴在单叶的叶脉2侧，用打孔器打取菌块（直径4 mm）在同样位置接种于单叶的叶脉2侧，培养皿补充少量清水，封口后置于生化培养箱中，每天14 h光照、10 h黑暗处理。每天观察叶片的发病情况，并测量病斑直径大小。

1.2.4 人参根块接种 取人参（与前面离体叶片所用的人参来自同一品系）根块置于空培养皿中，在每块人参根块上接种病原菌孢子悬浮液10μL，以没作任何处理的根块作为对照组，将培养皿放于25℃的培养箱中黑暗培养，观察人参根块的发病情况。

1.2.5 不同品系人参抗性评价 每个品系（编号：FS、SW、HS、FX2）摘取完全展开的叶片，采用菌块接种方法对人参叶片进行正面接菌，4组重复，以不接种病菌作为对照，将叶片置于含有吸水滤纸的培养皿中，培养测量方法同“1.2.3”。同时，采取4种不同品系人参的参须进行平行抗病性评价。

1.2.6 病害严重度分级 病害严重度分级标准：1为无明显损伤；2为病斑直径小于1.0 cm；3为病斑直径为1.0～1.5 cm；4为病斑直径为1.5～2.0 cm；5为病斑直径大于2.0 cm，病斑相连呈不规则大斑块；6为整片叶片侵染发病。计算病情指数。其中病情指数分为4级：1级，免疫，病情指数=0；2级，高抗（HR）0＜病情指数≤35.0；3级，中抗（MR），35.0＜病情指数≤50.0；4级，高感（HS），病情指数＞50.0。病情指数计算公式如下。

1.2.7 人参抗、感株系的参须回接试验 通过离体叶片方法从1 424株人参中筛选出人参抗病株50株，从中选取8株抗病株和8株感病株，取其参须进行回接试验，在每组抗感株系的参须上各接种病原菌孢子悬浮液10μL，于25℃的培养箱中黑暗培养，3 d后观察参须的发病情况。

1.3 数据分析

统计分析采用Prism 6软件对离体叶片接种法进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 人参离体叶片接种法分析

以相同浓度的菌悬液（1×106个/mL）分别采用正面和反面2种接种方法接种到人参同一植株不同叶片上，试验设置3组重复。对接种5 d后的叶片进行调查（图1），发现2种方法均可诱导叶片发病，对照组不发病，且叶片正面接菌比背面接菌发病更快，病斑更大。正面接种产生的病斑直径大小平均为2.01 cm，反面接种产生病斑大小的平均值为1.82cm。采用同样大小菌块（直径0.40 cm）进行接种（图1），结果表明，正面和反面2种接种方法均可诱导叶片发病，对照组不发病。正面接种产生的病斑直径大小平均为2.17 cm，反面接种产生的病斑直径大小平均为2.03 cm。比较正、反面2种接种方法的效果，正面接种要比反面更容易受到病原菌的侵染，对比菌液和菌块接种，菌块接种比菌液接种能产生更大的病斑，说明菌块接种发病效果更好。

图1 人参根腐病不同接种方法比较

2.2 人参离体叶片发病症状表现

利用离体叶片接种法接种，人参离体叶片发病症状表现如图2所示。从图2可以看出，接种3 d后，接种部位出现病斑；接种5 d后，病斑明显扩大且叶片开始发黄；接种7 d后，接种部位腐烂，叶片整体发黄，病斑几乎蔓延整个叶片；接种11 d后，整个叶片失绿且腐烂。因此可以确定接种5 d后对发病情况进行调查最为合适。

图2 人参离体叶片接种不同时间发病症状对比

2.3 人参根块接种法分析

将腐皮镰刀菌接种于人参根块上，回接验证效果见图3。从图3可以看出，接种3 d后，人参根块上面长有明显的病斑，病原菌生长旺盛，菌丝体向外延伸，根块有腐烂迹象。接种5 d后，根块开始泛黄，出现腐烂现象。接种7 d后，根块松软，且腐烂部位颜色加深，整个根块几乎全部腐烂。人参根块接种结果与离体叶片接种结果基本一致。

图3 人参根块回接验证

2.4 不同品系人参离体叶片接种抗性评价

接种5 d后，对叶片发病情况进行调查，调查结果见表1。FS发病情况最轻，病斑直径最小，HS发病情况最严重，病斑直径最大，SW和FX2发病情况差不多，SW病斑直径比HS略微小一些。通过统计病斑直径可知，4个品系中，FS抗病性最强，HS抗病性最差；通过计算其病情指数可知，FS为高抗等级，SW为中抗等级，HS和FX2为高感等级。

表1 不同品系人参叶片抗病性鉴定

2.5 不同品系人参须接种抗性评价

采取4种不同品系人参的参须进行抗病性评价（图4）。接种3 d后，对参须发病情况进行调查，发现FS参须腐烂情况最轻，SW和HS居中，FX2发病情况最严重，说明FS抗病性最强，FX2抗病性最差，该结果与离体叶片抗性评价基本一致。

图4 不同品系人参须抗病性鉴定

2.6 人参抗、感株系的参须回接试验

取抗病株和感病株的参须，将腐皮镰刀菌悬液分别接种于参须上，回接验证结果见图5。结果发现接种3 d后，抗病株有轻微发病现象，参须腐烂情况不明显，感病株整体腐烂严重。通过参须回接试验进一步表明离体叶片接种法可用于人参根腐病的抗性筛选。

图5 人参须回接验证

3 小结与讨论

目前在三七中，已经采用离体叶片接种法建立了一种用于三七黑斑病抗性鉴定的方法［14］。在大豆中也有相关研究，可采用离体叶片接种的方法对大豆疫霉根腐病抗病性进行鉴定［15］。在水稻中，采用q-PCR和离体叶片相结合的方法对水稻纹枯病发病程度进行定量分析［16］。任琴琴等［17］通过分子标记与离体叶片接种方法相结合，对甜瓜蔓枯病抗感材料进行了筛选，成功筛选出了抗感株系。在西瓜中，建立了一种西瓜炭疽病菌离体叶片接种鉴定技术，可用于对炭疽病抗性进行鉴定［10］。张志刚等［18］通过分析小麦白粉病在室内植株上的发病特点，进行了离体叶片人工接种方法的探索，结果表明该方法可行。应用离体叶片法还可以对菠萝资源心腐病抗性进行鉴定［19］。研究表明［11］，离体叶片接种法可用于筛选木薯根腐病抗病资源，是一种高效、可靠的抗性筛选方法，为木薯抗病育种奠定了基础。林善海等［20］发明了一种采用离体叶片鉴定甘蔗梢腐病抗性的方法，该方法无需按照季节进行甘蔗种苗的种植，不受甘蔗苗龄和场地的限制，操作简便、重复性好，对大量样本的筛选具有较好的省工、省时的特点。戴桦均［12］通过研究明确了离体叶片接种法可用于植物根部病害抗性筛选的可行性，克服了传统根茎部病害抗性鉴定的不足。

本研究尝试将离体接种法应用于筛选人参根腐病抗病性的可能性，将人参根腐病接种到离体叶片上，并采用菌块、菌液2种不同接种方法分别对人参叶片正、反面进行接种，结果表明，正面接种要比反面接种更容易受到病原菌的侵染，菌块、菌液接种相比较，菌块接种发病效果更好。将病原菌接种到人参根块上，发现发病情况和叶片基本一致，通过2种离体接种方法比较，表明用离体叶片比用根块接种更加直观、简便，进一步通过人参抗感株系的参须回接试验，初步证明离体叶片接种法可以用于人参根腐病的抗性筛选。通过对不同品系人参进行接菌试验，发现FS抗病性最好，FX2抗病能力最差，通过统计病斑直径，计算其病情指数可知，FS为高抗等级，SW为中抗等级，HS和FX2为高感等级，试验表明离体叶片接种法可用于人参根腐病抗性筛选。本研究对人参根腐病离体抗性筛选方法进行了初步探究，发现该方法可用于对试验田的人参进行抗感株系的初步筛选，具有操作简便、植株发病症状明显、速度快、不伤害植物等优点，为人参根腐病抗性筛选提供更多辅助方法，为人参抗根腐病种质资源的筛选提供参考。