活性炭对秸秆和猪粪混合厌氧发酵产生物甲烷的影响

朱佳琪，陈芳清，黄永文，熊丹伟，刘杨赟

（1.三峡大学湖北省三峡地区生态保护与治理国际联合研究中心，湖北 宜昌 443002；

2.湖北正江环保科技有限公司，湖北 宜昌 443002）

秸秆厌氧发酵技术既能生产清洁生物能源，又能减少碳排放，是实现农作物秸秆资源化利用的有效途径之一［1］。秸秆厌氧发酵可分为秸秆单一底物厌氧发酵和秸秆与有机废弃物混合厌氧发酵。由于发酵基质碳含量高、氮含量相对低而出现的碳氮比失衡情况，秸秆单一底物厌氧发酵存在发酵进程缓慢、发酵效率低下等问题［2］。秸秆与其他有机废弃物混合厌氧发酵能克服这一缺陷，平衡发酵基质营养，促进微生物群落的生长与发育，达到加快厌氧发酵的进程、提高产气效率的目的［3，4］。秸秆厌氧发酵产生物甲烷通常利用沼气池和发酵罐进行，这类方式存在运输量大、残渣处理困难的问题［5］。日本名城大学田村广人教授研发出了在水稻田直接利用水稻秸秆进行厌氧发酵生产生物甲烷的技术（Methane gas as renewable energy at rice fields tian，GET）［6］。该技术的原理是利用特制的覆盖膜系统和水淹条件营造厌氧环境，将发酵基质和土壤混合后进行厌氧发酵，再通过集气装置收集生物甲烷并加以利用。因此，该技术除了能有效解决上述问题外，还能降低生产成本、改善土壤肥力。但是，由于该技术只使用秸秆作为发酵基质，发酵进程和产率一定程度上受到了限制。在此基础上，研发了水稻秸秆与农家有机肥田间混合厌氧发酵产甲烷的技术（Biological methane production from the mixed fermentation with rice straw and farm manure at field，BMP）［7］，通过改善发酵基质的碳氮比和发酵系统微生物的组成，有效地提高了生物甲烷的产率。

秸秆田间厌氧发酵产生物甲烷由于利用水稻田农闲季节进行，厌氧发酵进程的启动时间、产气量、底物降解效率和发酵周期常因温度较低而受到一定影响。加入以活性炭为代表的碳基导电材料作为添加剂被认为是一种能促进厌氧发酵进程的有效办法［8，9］。活性炭等碳基导电材料能聚集微生物，维持有利于微生物生长的环境，同时又能促进微生物种间电子直接转移，促进厌氧发酵进程和生物甲烷产量的提高［10-14］。上述相关研究结果均是在单一发酵基质上获得的，由于秸秆与农家肥田间混合厌氧发酵的基质与环境明显不同，该结果是否适用不得而知。本研究以秸秆与农家有机肥田间混合厌氧发酵产甲烷的技术原理为依据，构建了试验用厌氧发酵装置，以水稻秸秆和猪粪为混合发酵基质，以水稻田土壤为发酵的微生物来源，通过加入不同含量的活性炭，测定各处理发酵系统的产气量、挥发性脂肪酸、pH、秸秆降解率等指标的变化，揭示了活性炭对水稻秸秆与猪粪混合厌氧发酵进程和产生物甲烷的作用及其相关机制，为改善水稻秸秆与猪粪田间混合厌氧发酵生产甲烷技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻秸秆和土壤取自宜昌市农业科学院枝江试验站的水稻田，猪粪取自周边养猪场。将水稻秸秆剪成3～5 cm，所采取的秸秆、猪粪和土壤取样风干备用。水稻秸秆、猪粪的主要特性见表1。

表1 水稻秸秆和猪粪的主要理化特性

1.2 厌氧发酵试验

试验在实验室内进行，试验用的发酵装置包括用于填充土壤、秸秆和猪粪的厌氧发酵瓶（2 L）和应用排水法收集气体的集气瓶（550 mL）。厌氧发酵瓶的顶部设有取样口和与集气瓶连接的出口，厌氧发酵瓶和集气瓶用橡胶导气管连接。试验以活性炭为添加剂，共设置6个处理，活性炭的添加量分别是为发酵基质质量的1%、2%、3%、6%、8%和0%，各记为C1、C2、C3、C4、C5和CK（对照）。每个试验装置为1个试验单元，每个处理水平各包含3个重复。

在试验开始前，每个发酵装置以TS重量为基准，各加入120 g风干后的发酵基质（猪粪和秸秆各60 g）和80 g水稻田土壤（接种物），混合后按上述添加剂处理水平分别称取一定量的添加剂溶于1 L去离子水中，经搅拌摇匀后加入到发酵基质中。最后密封发酵装置，在中温（35±1）℃下进行为期90 d的混合厌氧发酵试验。

1.3 相关参数的测定

试验前发酵基质特性的测定。水稻秸秆和猪粪的总固体（TS）质量分数测定采用烘箱干燥（105±5）℃恒重法测定。发酵基质的挥发性固体（VS）质量分数的测定采用马弗炉下灼烧（550±20）℃恒重法测定。总有机质（TOC）采用重铬酸钾容量法测定。

产气量和甲烷含量的测定。每5 d采用排水法和气相色谱仪分别测定。

挥发性脂肪酸（VFAs）和pH的测定。每5 d吸取少量发酵液利用比色法测定其挥发性脂肪酸含量，同时用pH计测定pH。

秸秆含量的测定。试验前后分别从各处理取水稻秸秆样品，采用72%浓硫酸水解法、2 mol/L盐酸水解法和浓硫酸法测定纤维素、半纤维素和木质素含量［15］。

1.4 数据处理

分别统计各处理在不同时间的甲烷产量、挥发性脂肪酸（VFAs）含量以及pH，分析各处理水平产气的动态变化。以活性炭添加量为变量，累积产甲烷量、秸秆木质纤维素含量和降解率为因变量，采用SPSS 19.0软件进行单因子方差分析，分析不同添加量的活性炭对厌氧发酵产甲烷能力和秸秆降解的影响，当单因子作用达到显著水平时（P＜0.05），采用S-N-K法进行多重比较，分析各处理之间的差异水平。

2 结果与分析

2.1 厌氧发酵系统甲烷产量、p H和挥发性脂肪酸的时间动态

厌氧发酵系统的甲烷产量、pH和挥发性脂肪酸含量随发酵进程呈不同的动态变化格局（图1）。各活性炭处理的甲烷产量大体呈“双峰”变化趋势（图1a）。在发酵15 d后，各处理的产气量开始迅速增加，其中C1、C2和C3处理的产甲烷速率较CK处理快，各活性炭处理（C1、C2、C3、C4和C5）在第15～20天的甲烷产量为300.21、300.13、282.49、216.55和153.33 mL，分别比CK处理（227.61 mL）提高了31.90%、31.86%、24.11%、-4.86%和-32.63%。随后各处理在第35～40天到达第一个产甲烷高峰，各活性炭处理（C1、C2、C3、C4和C5）的第一个产甲烷峰值为478.97、497.92、549.47、405.35和427.26 mL，分别比CK处理（396.15 mL）提高了20.91%、25.69%、38.70%、2.32%和7.85%。发酵前45 d，各处理的累积甲烷产量均达到各自总累积甲烷产量的79%以上。第1次甲烷产量达到峰值后，各处理甲烷产量迅速下降，在第50天达到低点。随后，添加活性炭的处理甲烷产量再次上升，均在第60天达到第2个峰值，以C2处理的第2个峰值最高（267.57 mL），但对照组没有形成第2个产气高峰。

图1 添加活性炭对厌氧发酵系统甲烷产量、p H和挥发性脂肪酸的影响

各处理的pH呈“单谷”变化趋势（图1b）。随着发酵时间的延长，各处理pH先下降，至第15天达到最低点，其后迅速上升，CK组pH在第35天达到最高点（7.32），活性炭添加剂组均在第40天达到最高点，随后各处理pH在7.18～7.29波动。各处理pH最低点变化为5.78～5.90；最高点为7.32～7.39。

各处理的VFAs浓度均呈“单峰”变化趋势（图1c）。各活性炭处理VFAs含量峰值随活性炭添加量的增加呈下降趋势，各活性炭处理以C1处理峰值最高（2 977.29 mg/L），其余活性炭处理VFAs浓度峰值均低于CK处理（2 865.21 mg/L），并且CK处理到达峰值的时间明显晚于各活性炭处理。15 d后，各处理VFAs浓度总体呈下降趋势，并在45 d后保持在较低水平（299.17～657.04 mg/L）波动。

2.2 活性炭对甲烷产量的影响

活性炭的加入对混合厌氧发酵甲烷产量有显著影响（P＜0.05）（表2）。累积产甲烷量随活性炭添加量的增加呈先上升后下降的趋势。C2和C3处理对水稻秸秆与猪粪混合厌氧发酵产甲烷能力具有显著促进作用（P＜0.05），与CK处理相比，C2和C3处理累积产甲烷量分别提高了29.29%和28.04%。C1、C4和C5处理对累积产甲烷量无显著影响（P＞0.05），累积产甲烷量相比CK处理分别提高了9.52%、9.02%和-0.06%。

表2 各处理的累积产甲烷量和TS、VS产甲烷量

2.3 活性炭对秸秆木质纤维素降解的作用

活性炭对总木质纤维素、纤维素和半纤维素的降解有显著影响，但对木质素降解的影响不显著（表3）。活性炭的加入能显著提高秸秆中总木质纤维素的降解率（P＜0.05），C1、C2、C3、C4和C5处理的总木质纤维素降解率分别为（22.20±6.11）%、（26.38±2.46）%、（29.57±2.59）%、（24.35±5.04）%和（22.75±4.21）%，与对照组相比，分别上升了69.47%、101.47%、125.73%、85.88%和73.66%。各活性炭添加剂组的纤维素降解率与对照组相比均有显著性上升（P＜0.05），半纤维素降解率仅在C2和C3处理中存在显著性上升（P＜0.05）。各处理以C3处理的降解效果最好，总木质纤维素降解率为（29.57±2.59）%，纤维素、半纤维素、木质素的降解率分别为（45.35±4.42）%、（34.09±5.39）%、（-20.98±5.46）%。

表3 各处理对秸秆降解的影响 （单位：%）

3 讨论

3.1 活性炭对厌氧发酵系统产甲烷进程的影响

活性炭等碳基导电材料的添加是提高厌氧发酵产甲烷能力的一种重要手段。活性炭的添加首先会对厌氧发酵进程产生影响。厌氧发酵一般分为3个阶段，水解阶段、酸化阶段和产甲烷阶段［16］。在水解阶段，厌氧菌将复杂的有机物分解成分子量较小的氨基酸、可溶性单糖、甘油与脂肪酸，此时厌氧发酵系统产甲烷效率低，VFAs含量开始升高，同时pH开始下降。酸化阶段，在产氢产乙酸菌的作用下，第一阶段的中间产物如醇类和脂肪酸转化为乙酸、氢和二氧化碳等，此时VFAs含量上升至峰值，pH继续下降，同时甲烷产量开始上升。在产甲烷阶段，产甲烷菌将乙酸等简单有机物分解成甲烷和二氧化碳，二氧化碳在氢气的作用下还原成甲烷，此时的厌氧发酵系统产甲烷效率高，且VFAs含量由于产甲烷菌的利用而逐渐下降，pH开始上升。VFAs是秸秆厌氧发酵过程中反映微生物代谢的一个重要中间产物，其浓度变化、积累情况，均可体现水解、产氢产乙酸、产甲烷各阶段的底物转化速率情况［17］。pH的变化对产酸菌与产甲烷菌影响较大，产酸菌适应的pH为5～8，而产甲烷菌适应的pH范围较窄，为6.8～7.4。本研究中，在发酵前15 d，VFAs含量上升至峰值，同时甲烷产量处于较低水平，表明此时厌氧发酵系统处于水解和酸化阶段。15 d后，甲烷产量大幅上升，VFAs含量呈下降趋势，表明此时厌氧发酵系统处于高效产甲烷阶段。同时，整个厌氧发酵过程的pH均保持在产甲烷菌适宜的范围内。各处理各时期甲烷产量、VFAs含量变化与3阶段理论基本一致，其不同主要在于各处理甲烷产量和VFAs含量峰值的大小和出现时间。甲烷产量方面，各活性炭处理峰值大小均高于CK处理，VFAs含量方面，峰值出现的时间均早于CK处理。

活性炭由许多呈石墨型的层状结构微晶不规则地集合而成，具有多孔、比表面积大的结构，能够吸附发酵液中微生物的有害抑制物（如NH3、氢氧化铵、硫化物等），加快产甲烷菌对乙酸等的转化，同时为微生物的富集创造了环境，促进微生物种间直接电子转移，提高厌氧发酵系统产甲烷能力［18-21］。活性炭能促进互营VFAs氧化细菌（Gelria和Syntrophomonas）以及与种间直接电子传递相关的微生物（Geobacter和Methanosarcina）的富集，达到加速底物分解、提高产甲烷能力的目的［22］。因此，活性炭的加入对水稻秸秆与猪粪混合厌氧发酵进程的作用主要体现在提高微生物活性以加快厌氧发酵进程和提高反应程度［23］。但不同添加量的活性炭对厌氧发酵进程的促进作用有差异。Yan等［24］研究了活性炭对厌氧发酵系统产甲烷的作用，发现活性炭添加量在0.125～2.000 g/L，产甲烷速率与活性炭添加量呈正相关。本研究中，活性炭对厌氧发酵的促进作用随添加量的增加呈先上升后下降的趋势，以C3处理促进作用最佳。发酵初期C1、C2和C3处理的VFAs含量上升速率、产甲烷速率均比CK处理高，VFAs含量开始下降的时间较CK处理提前，产甲烷峰值大小均高于CK处理。可以看出，在厌氧发酵系统中加入适量活性炭能加速微生物对底物的利用，加快厌氧发酵进程和提高反应程度。

3.2 活性炭对厌氧发酵系统产甲烷能力的影响

活性炭等碳基导电材料的添加一般能促进厌氧发酵甲烷产量，但活性炭的添加量也有适宜范围，活性炭添加量太低和太高，促进效果均不显著，过高浓度的活性炭会降低厌氧发酵系统产生物甲烷的能力。秦向东等［25］研究了活性炭对杂交狼尾草厌氧发酵的影响，发现活性炭添加量仅在1.6 g/L时甲烷产量略有升高（1.34%），当添加量为2.0～8.0 g/L时，厌氧发酵系统产气量随着活性炭添加量的增加而减少。Pallavi等［26］研究发现，在高温条件下小麦壳与污泥混合厌氧发酵，总产气量随着颗粒活性炭浓度的增加而降低，当添加量高于30 g/L时，其总产气量低于对照组。本研究中活性炭的添加量分别为发酵基质质量的1%、2%、3%、6%和8%。结果表明，当活性炭添加量为发酵基质质量的2%时产甲烷促进效果最好。然而，随着添加量的增加，其促进效果呈减弱的趋势。其原因可能与活性炭添加对厌氧发酵系统中微生物群落结构与功能的影响有关。在一定添加量范围内，活性炭可以为微生物群落提供适宜的微生态环境，促进厌氧发酵微生物系统的形成与活动［27］。但是，当活性炭添加量增加到一定程度时，由于厌氧发酵系统中可利用的营养物质有限，微生物数量的急剧增加并不会引起生物甲烷产量同步增长，反而会因微生物间的竞争作用一定程度影响到生物甲烷产量［28］。

3.3 活性炭对厌氧发酵系统秸秆降解的影响

水稻秸秆中木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，厌氧发酵所产生物甲烷来自于水稻秸秆木质纤维素中碳的分解与转化［29］。伴随着厌氧发酵进程，秸秆的纤维素和半纤维素含量大幅降低，而木质素因降解困难，其在木质纤维素含量中所占比例反而略有升高［30］。甘荣等［31］研究了活性炭在中高温条件下对玉米秸秆厌氧发酵的影响，发现添加5 g/L活性炭使秸秆纤维素、半纤维素降解率分别提高了63%和56%。本研究中，活性炭的添加能显著促进秸秆中总木质纤维素的降解，其中对秸秆中纤维素降解率有显著影响，对半纤维素降解率的影响仅在C2和C3处理能达到显著性，而对木质素降解率无显著性影响。活性炭的添加对木质纤维素降解的促进作用，可能是由于活性炭吸附菌群后，改变了菌群数量和种类，富集强化了水解菌和产甲烷菌，从而提高秸秆降解率。

厌氧发酵中木质纤维素的降解程度与厌氧发酵系统产甲烷能力有直接的关系，本研究以猪粪和秸秆为发酵基质，通过添加活性炭来促进秸秆的降解和提高生物甲烷的产量。试验中秸秆木质纤维素的降解和厌氧发酵系统产甲烷性能的变化是趋同的。各处理秸秆总木质纤维素降解率越高，其累积甲烷产量也就越高。各处理中以C2和C3处理总木质纤维素降解率最高，分别为26.38%和29.57%，比对照提高了101.47%和125.73%，其累积甲烷产量也因此分别比对照组提高了29.29%和28.04%。该结果与已有的相关研究结果一致［32］。

本研究在实验室水平测试了活性炭对猪粪和秸秆混合厌氧发酵产生物甲烷的作用。在田间试验与生产中，考虑到应用成本，可利用生物炭来取代进行。生物炭一般是由植物根茎、木屑、秸秆等加工而成的一种多孔炭，常被用做常规炭质材料（如活性炭、碳纳米管和氧化石墨烯）的替代品［33］。其平均全碳含量达到64%，平均比表面积为124.83 m2/g。因此生物炭作为外源添加物对厌氧发酵产甲烷能力同样具有促进作用［34，35］。今后将进一步研究生物炭作为添加剂用于田间厌氧发酵产生物甲烷的可行性，以促进水稻秸秆与农家有机肥混合厌氧发酵产生物甲烷技术的推广与应用。

4 结论

活性炭的添加能调控厌氧发酵进程。添加量在1%～3%能加快厌氧发酵进程，并且能够维持厌氧发酵产甲烷系统的pH保持在6.76～7.39。添加适量的活性炭对秸秆与猪粪混合厌氧发酵系统产甲烷能力有显著的促进作用，在2%活性炭添加量的条件下促进效应最为显著，其累积甲烷产量与对照组相比提高了29.29%。活性炭的添加还能促进纤维素和半纤维素的降解。添加量在3%时对秸秆的降解作用最好，总木质纤维素降解率达到29.57%。