载阿霉素红细胞膜壳聚糖靶向纳米粒的制备及评

洪伟勇 周旭晖 金陈浩 王金明 郭钫元 杨根生

关键词红细胞膜;纳米粒;叶酸受体;靶向给药系统;抗肿瘤

恶性肿瘤严重威胁人类健康，化学药物治疗仍是目前主要的治疗手段之一。阿霉素（doxorubicin，DOX）是最常用的化学治疗药物，对乳腺癌、肺癌、膀胱癌等具有较明显的抗肿瘤作用，是多种肿瘤的一线化疗药物;但其具有骨髓抑制、心脏毒性、耐药性等缺点，从而限制了其临床应用[1]。红细胞是血液中數量最多、寿命最长的细胞，也是运送氧气的主要媒介[2];其作为内源性物质，具有极强的流动可塑性、高生物相容性、可生物降解性、超长的半衰期和低免疫原性等优点[3 - 6];通过修饰还可以将其构建成靶向肿瘤的药物递送系统[7-9]，现已成为抗肿瘤药物研发的一个新热点。叶酸（folic acid，FA）受体是公认的肿瘤细胞生物标志物，在大量肿瘤（特别是乳腺癌、宫颈癌、肝癌等多种实体瘤）中过表达[7，10]，而在正常细胞中很少表达，是理想的靶向药物递送受体[11-12]。

基于此，本研究以DOX为模型药物，壳聚糖为载体材料，采用离子交换法制备载阿霉素壳聚糖纳米粒（DOX-CS-NPs），将FA 和氨基聚乙二醇磷脂（NH2-PEG2000-DSPE）通过共价连接后修饰红细胞膜（RBC），并构建靶向肿瘤细胞FA受体的载阿霉素红细胞膜壳聚糖靶向纳米粒（FA-RBC-DOX-CS-NPs），考察该纳米粒的理化性质和体外释药特性，并评价其抗肿瘤活性，以期为DOX的新制剂开发提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有IL-161CT型CO2培养箱[施都凯仪器设备（上海）有限公司]，Malvern ZS90 型激光纳米粒径仪（英国马尔文仪器有限公司），Nicolet 6700 型傅里叶变换红外光谱仪、Fresco 21 型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司），ELx800 型酶标仪（美国BioTek 公司），UV-2102 型紫外可见分光光度计（美国Unocal 公司），LSM 900 型共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss 公司），X’pert PRO 型X 射线衍射仪（荷兰PNAlytical 公司），AVANCE-Ⅲ型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。

1.2 主要药品与试剂

FA、壳聚糖和三聚磷酸钠（批号分别为20180607、20181009、201812110）购于上海阿拉丁生化科技有限公司;NH2-PEG2000-DSPE（批号20181022）购于上海凡硕生物科技有限公司;DOX（批号20180809）购于武汉远成共创科技有限公司;DMEM 高糖培养基（批号19126245）购于美国Sigma 公司;MTT 试剂（批号2002316）购于北京索莱宝科技有限公司;DAPI 染色液（批号20191116）购于上海颖心实验室设备有限公司;1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC，批号20180928）购于浙江普康化工有限公司;N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，批号20180821）购于上海麦克林生化科技有限公司;其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。

1.3 细胞

人乳腺癌MCF-7 细胞购于上海生命科学研究所细胞资源库。

1.4 动物

本研究所用动物为健康雄性SD大鼠，共9 只，体质量为180～200 g，鼠龄为8 周，由浙江省医学科学院提供，动物生产许可证号为SCXK（浙）2019-0002。实验期间正常光照，动物饲养室环境温度为20～22 ℃，相对湿度为55%～60%，大鼠自由饮水采食。

2 方法

2.1 叶酸氨基聚乙二醇磷脂的合成

取7.94 mg FA溶于10 mL无水二甲基亚砜（DMSO）中，加入6.9 mg EDC和4.14 mg NHS，室温避光活化4 h，加入30 mg NH2-PEG2000-DSPE，避光，室温反应24 h（具体合成路线见图1），然后置于去离子水中透析（透析袋截留相对分子质量为3 000 Da）36 h，收集产物并冻干，即得叶酸氨基聚乙二醇磷脂（FA-PEG2000-DSPE）。采用核磁共振氢谱（1H-NMR）表征FA、NH2-PEG2000-DSPE和FA-PEG2000-DSPE的结构。

2.2 RBC的制备

取SD雄性大鼠血液，加入10 倍体积的1×磷酸盐缓冲液（PBS），于4 ℃下以4 500 r/min 离心10 min，取沉淀，以1×PBS洗涤3 次，即得红细胞。将红细胞置于4 倍体积的0.25×PBS 中，于4 ℃下低渗处理40 min，以释放红细胞内容物;再以8 000 r/min 离心15 min，取沉淀，以0.25×PBS洗涤2 次，即得粉色的RBC，备用。

2.3 FA修饰RBC的表征

取“2.1”项下FA-PEG2000-DSPE 适量，以1×PBS 配制成质量浓度为50 μg/mL 的溶液（2 mL），加至等体积RBC溶液中，置于37 ℃、100 r/min 摇床上避光孵育1 h;再于4 ℃条件下用1×PBS洗涤离心（8 000 r/min）2 次，即得FA修饰的RBC（FA-RBC）。采用傅里叶变换红外光谱仪测定RBC和FA-RBC的结构。

2.4 DOX-CS-NPs的制备与表征

采用离子交联法制备DOX-CS-NPs[13]。在25 ℃、400 r/min 的磁力搅拌下，于壳聚糖醋酸溶液（pH6.0）中加入DOX溶液，缓慢滴加三聚磷酸钠溶液至产生乳光，继续磁力搅拌10 min 得纳米粒混悬液;将纳米粒混悬液置于超滤管（100 kDa）中离心（4 000 r/min），即得DOX-CS-NPs。其中，DOX溶液、壳聚糖醋酸溶液、三聚磷酸钠溶液的质量浓度分别0.5、1.5、0.4 mg/mL，体积比为5 ∶5 ∶4。采用激光纳米粒径仪测定该纳米粒的粒径、多分散性指数（polydisepersity index，PDI）和Zeta电位。

2.5 DOX-CS-NPs包封率和载药量的测定

取适量DOX（质量记为M）按“2.4”项下方法制备纳米粒混悬液并超滤，取下清液，采用紫外可见分光光度计测定其中DOX 含量（记为M1）[14]。取超滤膜上纳米粒，冻干，称质量（记为M2）。计算包封率和载药量，具体公式如下：包封率（%）=（M-M1）/M×100%，载药量（%）=（M-M1）/M2×100%。

2.6 FA-RBC-DOX-CS-NPs的制备及表征

采用细胞破碎仪处理FA-RBC（功率100 W，先破碎4 s，间隔5 s 后，再破碎5 s），将破碎后的FA-RBC 和DOX-CS-NPs 经400 nm 聚碳酸酯膜挤压3 次后，再经200 nm 聚碳酸酯膜挤压5 次，即得FA-RBC-DOXCS-NPs。采用激光纳米粒径仪测定其粒径、PDI 和Zeta电位。

2.7 体外释放特性考察

分别取适量DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC-DOXCS-NPs 置于不同透析袋中，再将各透析袋分别置于pH7.4（模拟体循环环境）和pH6.5（模拟肿瘤微环境）的PBS溶液（释放介质）中，于37 ℃、100 r/min 摇床上进行透析。在预定的时间点（1、2、4、8、12、24、48、72 h），取出10 mL释放介质并补充等量新鲜介质，按“2.5”项下紫外分光光度法测定取出的释放介质中DOX的含量，并计算累积释放率。

2.8 体外抗肿瘤活性考察

取对数生长期的MCF-7 细胞，以1×104个/孔接种至96 孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h 后，弃去原培养基，分别加入含DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBCDOX-CS-NPs 的培养基（以DOX计，质量浓度均分别为0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、5.000 μ g/mL），每孔100 μL，各浓度平行5 份;另设对照组（只加细胞不加药物）。培养48 h 后，加入10 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h;吸出培养基，加入DMSO 150 μL，采用酶标仪于570 nm波长处测定各孔光密度（optical density，OD）值，并计算细胞存活率，细胞存活率（%）=（给药组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

2.9 细胞摄取实验

取对数生长期的MCF-7 细胞，以1×104个/孔接种至96 孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h 后，弃去原培养基，分别加入含DOX、FA-RBC-DOX-CS-NPs 和FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs（游离FA用于封闭受体以验证纳米粒的入胞作用是否由FA受体介导）的新鲜培养基（以DOX计，质量浓度均为5 μg/mL）;另設不加药物的空白组。于培养1、4 h 时移除培养基，以4%多聚甲醛固定30 min;以PBS 洗涤后，用10 μg/mL 的DAPI 染色1 h，采用共聚焦显微镜观察细胞的摄取情况。

3 结果与分析

3.1 FA-PEG2000-DSPE的合成结果

FA、NH2-PEG2000-DSPE 和FA-PEG2000-DSPE 的1H-NMR 如图2～ 图4 所示。对比图谱可知，图4 中7.73～7.55 ppm（e）和6.75～6.49 ppm（f）位置的2 个峰分别对应FA苯环上的H原子;8.11 ppm（d）和6.94 ppm（g）位置的2 个峰分别对应FA 上—NH—基团的H 原子;4.33 ppm（b）、4.49 ppm（h）、8.65 ppm（i）位置的峰也与FA的1H-NMR相符;3.51 ppm和1.24 ppm位置的峰分别属于NH2-PEG2000-DSPE 中—C17H35、—OCH2CH2— 基团上的H原子。由此表明，载体材料FA-PEG2000-DSPE合成成功。

3.2 FA修饰RBC的表征结果

傅里叶变换红外光谱仪检测结果（图5）显示，1 601.1 、1 451.4 cm-1为FA-RBC 中FA上苯环νC=C的骨架振动峰;3 294.8 cm-1归属于FA上的羟基;864.5 cm-1为FA苯环对位二取代的振动峰;1 156.1 cm-1为N—H振动峰。由此可知，FA已被成功修饰至RBC上。

3.3 DOX-CS-NPs的表征结果

DOX-CS-NPs 的载药量为（15.09±1.36）%，包封率为（60.99±0.92）%，平均粒径为（152.500±2.554）nm，PDI 为0.124±0.042，Zeta 电位为（10.100±0.216）mV，其中粒径分布和Zeta 电位见图6。由此可知，DOX-CSNPs的粒径较小、分布均匀。

3.4 FA-RBC-DOX-CS-NPs的表征结果

FA-RBC-DOX-CS-NPs 的平均粒径为（254.200 ±2.651）nm，PDI为0.199±0.031，Zeta 电位为（-10.100±0.213）mV，具体见图7。由于RBC 本身带负电，DOX-CS-NPs经FA-RBC包被后由带正电荷转变为带负电荷，由此可知，FA-RBC-DOX-CS-NPs 已被成功构建。

3.5 体外释放特性考察结果

由体外释放曲线（图8）可知，在2 种释放条件下，DOX 原药均释放最快，DOX-CS-NPs 次之，FA-RBCDOX-CS-NPs最慢。在pH7.4 的释放介质中，DOX在8 h左右释放完全，DOX-CS-NPs 在72 h 左右释放完全，FA-RBC-DOX-CS-NPs 在72 h 的累积释放率约为90%。在pH6.5 的释放介质中，这3 种药物（制剂）的释放速率均比在pH7.4 的释放介质中快，DOX在2 h 左右释放完全，DOX-CS-NPs 在12 h 内释放完全，FA-RBCDOX-CS-NPs 在36 h 内释放完全。由此可知，DOX-CSNPs和FA-RBC-DOX-CS-NPs 在模拟肿瘤微环境（pH6.5）中的释药速率均快于生理条件（pH7.4），这一特性可以减少药物在体循环中的释放，增加药物在肿瘤组织中的释放，从而减少副作用，增强药物抗肿瘤疗效。Evans 等[15]研究发现，在生理条件（pH7.4）下，红细胞发生溶血的概率不大，而肿瘤微环境（pH6.5）中，红细胞会出现强烈溶血。笔者推测这可能是FA-RBC-DOX-CSNPs在肿瘤微环境（pH6.5）中释放速率显著增加的原因之一。

3.6 体外抗肿瘤活性考察结果

DOX、DOX-CS-NPs、FA-RBC-DOX-CS-NPs 对MCF-7细胞增殖活力的影响见图9。由图9 可知，当DOX质量浓度在0.500～5.000 μg/mL 范围内，3 种药物（制剂）对MCF-7 细胞的抑制作用均呈浓度依赖趋势，MCF-7 细胞的增殖能力随着DOX质量浓度的升高而减弱。当DOX质量浓度在0.010～5.000 μg/mL 范围内时，DOX-CSNPs和FA-RBC-DOX-CS-NPs 对MCF-7 细胞的抑制效果不如DOX明显，这可能是由于上述2 种纳米制剂将药物包裹在纳米粒内，使其释放速率减慢，短时间内无法直接作用于肿瘤细胞。

3.7 细胞摄取实验结果

在体外抗肿瘤活性结果的基础上，为研究FA-RBCDOX-CS-NPs 对肿瘤细胞的靶向性和侵袭能力，考察了DOX 质量浓度为5 μg/mL 时，经DOX、FA-RBC-DOXCS-NPs和FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs 處理1、4 h 后DOX的入胞行为，结果见图10。由图10 可知，处理1 h 后，3种药物（制剂）均被细胞摄取，但在细胞内的浓度均较低，且差别不大。处理4 h 后，细胞内3 种药物（制剂）的荧光强度均增强，表明细胞对DOX的摄取随作用时间的增加而增加;其中FA-RBC-DOX-CS-NPs 处理后的细胞的荧光强度最强，DOX次之，FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs 最弱。由此可知，FA-RBC-DOX-CS-NPs 能主动识别肿瘤细胞表面的FA 受体并特异性结合，从而提高DOX的入胞效率。FA+FA-RBC-DOX-CS-NPs 处理细胞后，细胞表面受体被游离FA 封闭，无法靶向识别纳米粒，从而降低了DOX的入胞效率。

4 结语

本研究以DOX为模型药物，用壳聚糖和三聚磷酸钠采用离子交联法制备了DOX-CS-NPs，再用经FAPEG2000-DSPE 修饰后的RBC，构建得到FA-RBCDOX-CS-NPs。该纳米粒的平均粒径为（254.200 ±2.651）nm，PDI为0.199±0.031，Zeta 电位为（-10.100±0.213）mV。细胞实验结果也表明，该纳米粒对肿瘤细胞表面高表达的FA受体有明确的靶向性，能有效提高药物的入胞效率，实现肿瘤细胞内药物富集。