Legumain酶和线粒体双级靶向去氢骆驼蓬碱脂质体的制备及其体外特性评价

伊帕尔古丽·阿皮孜 贺宏吉 王昭志 李喆喆 卡迪热娅·艾克拉木 白静雅 王梅

关键词去氢骆驼蓬碱;线粒体;Legumain酶;脂质体

肝癌严重影响着人类的生活，其中，我国肝癌的发病例数占全球的55%[1-3]。在肝癌的药物治疗方面，由于化疗药物的全身毒性或严重不良反应，导致患者生存质量下降[4]。研究与开发安全高效的药物递送系统，有望降低化疗药物毒性反应的严重程度，同时维持或提高治疗效果。

去氢骆驼蓬碱（harmine，HM）是从骆驼蓬种子中分离出来的生物碱。研究显示，HM通过抑制蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡，并通过G2 细胞周期阻滞和线粒体途径诱导肝母细胞瘤HepG2 细胞凋亡[5-6]。然而，由于HM溶解度低且在大剂量下易引起神经毒性，导致其临床应用受限。线粒体是一种高度活跃的细胞器，通过不断分裂和融合来维持细胞的正常生理功能[7]。线粒体动力学失调通常会影响肿瘤细胞的能量供应、氧化还原信号和代谢功能。由于线粒体的功能障碍在肿瘤发展中起着至关重要的作用，已被确定为治疗肿瘤的关键靶点[8]。Legumain酶，又称天冬酰胺内肽酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族，最初发现于豆类植物[9]。研究表明，Legumain 酶在不同类型的实体肿瘤中表达上调，其水平与肿瘤的恶性潜能呈正相关[10]。KA肽由Legumain 酶响应氨基酸序列和线粒体靶向肽KLA 序列组成，其双级靶向特点有待进一步考察[11-12]。

为提高HM进入肿瘤细胞及其线粒体的效率，降低HM的毒副作用，本研究以大豆磷脂（soybean phospholipid，SPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、胆固醇（cholesterol，Chol），以及KA肽偶联的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000-KA）为材料负载HM，得到Legumain 酶和线粒体双级靶向HM脂质体（KA@HM-LPS），并对其制剂学特性、体外抗肿瘤作用及生物相容性进行初步评价，以期为后续研究提供实验基础。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究的主要仪器有UV-2700 型紫外可见分光光度计[岛津（上海）实验器材有限公司]，R-2003 型旋转蒸发仪、SHZ-95B型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），HWS-24 型电子恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），KQ5200DE型超聲清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BSA124S型电子分析天平（德国Sartorius 公司），3-18KS 型台式高速冷冻离心机（美国Sigma 化学公司），VCX500 型超声波破碎仪（美国Sonics公司），610000 型微型脂质体挤出器（美国Avanti 公司，孔径为100 nm 的聚碳酸酯膜），PHSJ-3F 型pH 计（上海雷磁创益仪器仪表有限公司），Nano ZS 型纳米粒径仪（英国Malvern 公司），Modulyo 型真空冷冻干燥机、371型CO2培养箱、HerasafeTM KS 型Ⅱ级生物安全柜（美国Thermo Fisher Scientific 公司），85-2 型恒温磁力搅拌器（常州金坛精达仪器制造有限公司），ZWYR-D2402 型恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司），Victor Nivo型多功能酶标仪（美国PerkinElmer 公司），JEM-1230 型透射电镜[JEOL 捷欧路（北京）科贸有限公司]，ECLIPSE Ti 型激光共聚焦显微镜[Nikon 仪器（上海）有限公司]，SX-500型全自动高压灭菌锅（日本Tomy DigitalBiology公司）。

1.2 主要药品与试剂

本研究的主要药品与试剂有HM标准品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号Q041-180308，高效液相色谱法测得含量>98%），SPC[艾伟拓（上海）医药科技有限公司，批号SY-SO-200401]，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000）、DPPC、Chol（西安瑞禧生物科技有限公司，批号分别为LP-R4-039、CC0657、RA0200624），胎牛血清、青霉素、链霉素溶液、胰酶MEM培养基（美国Gibco 公司，批号分别为2173969RP、2129299、2186962、8121247），磷酸盐缓冲液（PBS，美国Hyclone 公司，批号AG29574691），Dil 细胞膜红色荧光探针（ 上海碧云天生物技术有限公司，批号010421210629），MitoLite Blue FX490 线粒体蓝色荧光染料（美国AAT Bioquest 公司，批号1771462），CCK-8 试剂盒（ 北京博奥森生物技术有限公司，批号BA03175388），基质胶[ 康宁（上海）有限公司，批号1060001]，甲醇（天津市化学试剂有限公司，批号20211101410），DSPE-PEG2000-KA（本实验室自制，批号20210828），其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞与动物

人正常肝癌细胞SK-Hep-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司;Legumain 酶过表达的人肝癌细胞SK-Hep-1（LGMN+-SK-Hep-1）在本实验室通过慢病毒介导转染的方法获得[13];人正常肝细胞LO2 由新疆医科大学药学院艾尼娃尔·艾克木教授课题组赠送;雄性BALB/c裸鼠（8周龄，22～24 g，生产许可证SCXK-2016-0006）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 HM含量测定方法的建立

2.1.1 HM标准曲线的建立精密称取HM标准品10mg，用甲醇溶解，并定容至10 mL，制成质量浓度为1mg/mL的HM标准品贮备液。将其用甲醇稀释，制得质量浓度为10 μg/mL的HM标准品溶液，置于紫外可见分光光度计上进行全波长扫描。结果显示，HM在240、300 nm 波长处均有较高的吸收，但是240 nm 波长接近于紫外末端，因此，选择300 nm作为检测HM含量的最佳吸收波长。将HM标准品溶液用甲醇稀释得到质量浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL 的系列溶液，分别于300 nm波长处测定吸光度（A）值，以A值对质量浓度（C）进行线性回归，得HM的回归方程为A=0.082 8C+0.005 2（R2=0.999 5），表明HM检测质量浓度的线性范围为1～10 μg/mL。

2.1.2 方法学考察（1）精密度试验：将“2.1.1”项下制备的HM标准品溶液用甲醇稀释到质量浓度分别为4、6、8 μg/mL（低、中、高浓度），在300 nm波长处分别于0、12、24 h 检测以考察日内精密度，于0、24、48、72 h 检测以考察日间精密度，结果显示，低、中、高浓度HM的日内精密度RSD 分别为0.26%、0.25%、0.41%，日间精密度RSD 分别为0.48% 、0.17% 、0.87% ，均小于2.00%（n=6），说明方法的精密度良好。（2）稳定性试验：取“2.2.1”项下采用薄膜分散法结合挤出法制备的KA@HM-LPS 1 mL，分别在室温条件下放置0、2、4、8、16、24 h 后，用甲醇溶解并定容至50 mL，在300 nm波长处测定A 值。结果显示，A 值的RSD 为1.97%，小于2.00%（n=6），说明方法的稳定性较好。（3）重复性试验：取“2.2.1”项下采用薄膜分散法结合挤出法制备的KA@HM-LPS 100 μL，用甲醇溶解并定容至5 mL，在300 nm 波长处测定A 值。结果显示，A 值的RSD 为1.74%，小于2.00%（n=6），说明方法的稳定性较好。（4）加样回收率试验：从“2.1.1”项下制备的HM標准品贮备液中分别精密量取0.2、0.3、0.4 mL 置于50 mL 容量瓶中，各加0.5 mL 空白脂质体（KA@BLPS），用甲醇定容至刻度，得到HM质量浓度分别为4、6、8 μg/mL（低、中、高浓度）的供试品溶液。检测300 nm波长处的A 值，以评价加样回收率。结果显示，低、中、高浓度HM对应的加样回收率（n=3）分别为（99.30±0.47）%、（101.00±1.40）%和（104.10±0.33）%，表明方法的准确度较好[14]。

2.2 KA@HM-LPS制备方法的选择

2.2.1 KA@HM-LPS 的制备分别采用逆相蒸发法、pH梯度法和薄膜分散法制备KA@HM-LPS。（1）逆相蒸发法：按照质量比10 ∶10 ∶5 ∶1 ∶1，精密称取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA 和HM 标准品，用适量有机相（氯仿-甲醇混合液，体积比2 ∶1，下同）溶解，加入有机相1/3 体积的去离子水，冰浴超声2 h（100 W），减压旋蒸（压力0.05 MPa，转速100 r/min，下同）至有机溶剂除尽[15]，用微型脂质体挤出器挤出3 次，得KA@HM-LPS。（2）pH 梯度法：按照质量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，精密称取SPC、DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-KA和HM标准品，用适量有机相溶解，减压旋蒸形成干燥的脂膜，加入有机相1/3 体积的柠檬酸缓冲液（浓度为50 mmol/L），此时的pH值为2.0;超声水合30 min（100 W），形成的混悬液用碳酸钠缓冲液（浓度为150 mmol/L）调节pH值至7.0，磁力搅拌（室温，转速200 r/min）2 h，微型脂质体挤出器挤出3 次，得KA@HM-LPS[16]。（3）薄膜分散法：按照质量比10 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 1，精密称取SPC、DPPC、Chol、DSPEPEG2000-KA和HM标准品，用适量有机相溶解，减压旋蒸形成干燥的脂膜，加入有机相1/3 体积的去离子水，超声水合30 min（100 W），用微型脂质体挤出器挤出3 次，得KA@HM-LPS[17]。

2.2.2 脂质体的表征分别对逆相蒸发法、pH 梯度法和薄膜分散法制备的KA@HM-LPS进行表征。（1）分离效率的测定：精密称取HM标准品5 mg，加入KA@BLPS5 mL，超声5 min，使之混匀，得到质量浓度为1 mg/mL的HM物理混合液。取HM物理混合液1 mL，置于超滤离心管（截留分子量为10 kDa）中，离心2 次（转速6 000r/min，每次20 min），每次离心前加入去离子水1 mL，混匀3 次。离心结束后，将外管中的游离药物用甲醇定容至5 mL，测定HM的浓度，采用分离效率评价方法的可行性。根据公式① 计算得到分离效率为（97.00 ±1.67）%，说明超滤法适用于游离HM 与脂质体的分离[18]。因此，采用超滤法测定包封率。（2）包封率的测定：精密量取KA@HM-LPS 1 mL，与上述同法测定其游离药物的量（W游离）;另取1 mL KA@HM-LPS，用甲醇破乳并定容至50 mL，测定总药物的量（W总），根据公式②计算包封率。（3）载药量的测定：精密量取KA@HM-LPS1 mL，冷冻干燥24 h，通过减重法测定KA@HM-LPS的量（WKA@HM-LPS），根据公式③计算载药量。（4）取0.5 mLKA@HM-LPS，加0.5 mL 去离子水混匀，分别测定粒径、多分散系数（polydispersity index，PDI）和Zeta电位。

数据分析应用SPSS 26.0 软件，计量资料以x±s 表示;组间对比时，数据首先采用单因素方差分析，而后采用Tukey HSD事后检验，并采用Bonferroni 法校正显著性水平的Tukey HSD事后检验结果，检验水准α=0.05。结果显示，逆相蒸发法、pH梯度法和薄膜分散法制备的KA@HM-LPS包封率及载药量差异有统计学意义（P<0.001），而粒径差异无统计学意义（P>0.05）。其中，薄膜分散法制备的KA@HM-LPS包封率和载药量最高（表1），因此，选择薄膜分散法制备KA@HM-LPS用于后续实验。根据薄膜分散法制备的KA@HM-LPS呈负电荷，说明其在体内的毒性可能较低。KA@HM-LPS原液（未经过稀释的脂质体）借助透射电镜观察其形态，如图1 所示。由图1 可见，KA@HM-LPS呈类圆形，粒径大小跟粒径仪测定的平均粒径相差不大[19]。另外，将KA@HM-LPS材料中的DSPE-PEG2000-KA 替换成DSPE-mPEG2000，按KA@HM-LPS 相同的制备方法制备未修饰脂质体（HM-LPS）。

2.3 KA@HM-LPS均质化方法的选择

分别采用探针超声法和挤出法进行KA@HM-LPS均质化。（1）探针超声法：将KA@HM-LPS置于冰浴中，探针超声10 min（150 W，工作3 s、停止2 s），共3 次。（2）挤出法：将KA@HM-LPS在37 ℃保温条件下用微型脂质体挤出3 次。分别比较2 种方法所得KA@HM-LPS的粒径和包封率。数据分析和统计方法同“2.2.2”项下。结果显示，与探针超声法相比，挤出法处理的KA@HMLPS包封率较低、粒径较小（P<0.01），因此，本研究选择挤出法作为均质化方法用于后续实验。结果见图2。

2.4 KA@HM-LPS的血清稳定性评价

首先，取KA@HM-LPS 5 mL，依次在- 20 ℃ 和- 80 ℃ 冰箱中各预冻12 h;放入冷冻干燥机中，于- 55 ℃减压条件下干燥24 h，得KA@HM-LPS 冻干粉。精密称取1 mg KA@HM-LPS冻干粉，混悬在3 mL含10%胎牛血清的培养基中，于37 ℃恒温孵育24 h，模拟生理环境。分别在第0、1、2、4、6、8、10、12、24 h 时测定KA@HM-LPS 的粒径，观察血清对KA@HM-LPS 稳定性的影响[20]。结果显示，KA@HM-LPS的粒径在12 h后几乎未再变大，说明稳定性良好。结果见图3。

2.5 KA@HM-LPS的血浆稳定性评价

为评价KA@HM-LPS 的血浆稳定性，测定其在20%血浆中的体外释放率。通过眼眶取血法从BALB/c裸鼠采集全血，将1 mL 裸鼠全血（加抗凝剂）以2 500r/min 离心10 min，吸取最上层的血浆部分，并用生理盐水按照1 ∶ 5 稀释，得到20%的血浆样本。将“2.4”项下KA@HM-LPS 冻干粉和游离HM 分别混悬在20%的BALB/c裸鼠血浆中，调节HM的质量浓度为100 μg/mL，体积为2 mL，放入透析袋内（截留分子量为14 kDa），两端系好，置于含40 mL 等渗PBS（pH=7.4）的50 mL EP管中，在37 ℃恒温条件下以150 r/min 振摇。分别在第1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 取样1 mL（每次取样后补充同温、等体积、等渗PBS），加甲醇1 mL混匀，采用紫外分光光度法测定HM的含量，计算体外释放率[14]。结果显示，KA@HM-LPS的体外释放率在72 h 时为（90.80±1.28）%，而HM在24 h 时已达到（91.00±1.18）%，详见图4。此外，将KA@HM-LPS的体外释放曲线分别与零级、一级、Higuchi 和Weibull 函数方程拟合，其拟合优度分别为0.767 1、0.988 9、0.921 3 和0.996 3，体外释放曲线更符合Weibull 分布，说明KA@HM-LPS 具有缓释效果。

2.6 KA@HM-LPS的毒性评价

2.6.1 血液相容性为预测KA@HM-LPS在体内的血液相容性，测定其在2%红细胞悬液中的溶血百分数。通过眼眶取血法从BALB/c 裸鼠采集抗凝全血1 mL，离心数次（转速2 500 r/min，时间10 min），每次离心前均去掉上清液，加生理盐水混匀。当上清液变得无色透明时，加入生理盐水定容至50 mL，得到2%红细胞悬液。將“2.4”项下KA@HM-LPS冻干粉用生理盐水制成质量浓度为40、80、120、160、200 μg/mL 的混悬液，加入等体积的2%红细胞悬液，于37 ℃保温孵育2 h。阳性对照为去离子水，阴性对照为生理盐水。以200 r/min 离心5min，取上清液，采用紫外可见分光光度计在416 nm 波长处测定A值，根据公式④计算溶血百分数[21-22]。各质量浓度（以HM计算）KA@HM-LPS 的溶血百分数分别与游离HM（质量浓度为40 μg/mL）对比。

2.6.2 KA@BLPS 对正常肝细胞存活率的影响为考察KA@BLPS 对正常肝细胞的毒性，将人正常肝细胞LO2 按照5 000 个/孔接种至96 孔板中，并在5%CO2、37 ℃培养箱中培养12 h。按照不同质量浓度[0（空白）、25、50、100、200、400 μg/mL]加入KA@BLPS，继续培养48 h。另设空白调零组，不加细胞和药物，只加培养基。每个孔中加入10 μL CCK-8 孵育2 h，采用酶标仪在450nm波长处测定A值，并根据公式⑤计算细胞存活率。结果显示，当KA@BLPS 的质量浓度达到400 μg/mL 时，LO2 细胞的存活率为（94.40±6.12）%，说明载体的毒性很小，生物相容性较好。结果见图5A。

本课题组前期研究显示，Legumain 酶在肝癌细胞中的表达量低于在肝癌组织中的表达量[13]。为进行KA@HM-LPS 的体外特性评价，本研究采用Legumain酶过表达人肝癌细胞系。取人正常肝癌细胞SK-Hep-1和LGMN+-SK- Hep-1，分别按照5 000 个/孔接种至96 孔板中，5%CO2、37 ℃培养箱中培养12 h。按照不同质量浓度[0（ 空白）、20、40、60、80、100 μ g/mL] 加入KA@HM-LPS，孵育48 h。每个孔中加入10 μL CCK-8孵育2 h，采用酶标仪在450 nm波长处测定A值，并根据公式⑤计算细胞存活率[24]。

数据分析和统计方法同“2.2.2”项下。结果显示，LGMN+-SK-Hep-1 的细胞存活率要显著低于SK-Hep-1（P<0.001），表明KA@HM-LPS 对LGMN+-SK-Hep-1细胞的抑制作用显著大于SK-Hep-1 细胞，初步说明KA@HM-LPS 具有显著的Legumain 酶响应性。结果见图5B。

2.8 Legumain 酶过表达对KA@HM-LPS线粒体靶向性的影响

由于HM无自发荧光特性，为观察KA@HM-LPS被KA肽介导细胞的摄取和定位情况，将HM替换成Dil 细胞膜红色荧光探针，采用与KA@HM-LPS相同的制备方法得到Dil 负载的KA 肽修饰脂质体（KA@Dil-LPS）。取SK-Hep-1 和LGMN+-SK-Hep-1 细胞，分别接种到Confocal 皿中，每皿1×104个细胞，在5%CO2、37 ℃条件下培养12 h。加入KA@Dil-LPS 孵育6 h，其中Dil 的终浓度为2 μmol/L[25]。将细胞用预热的无血清胰酶MEM培养基清洗3 次，根据MitoLite Blue FX490 线粒体蓝色荧光染料试剂盒检测结果标记各组细胞的线粒体，置于共聚焦显微镜下观察KA@HM-LPS 在2 种细胞中的摄取情况与线粒体靶向性[26]。结果显示，在Legumain 酶过表达的LGMN+-SK-Hep-1 细胞中，KA@Dil-LPS 更多地被细胞摄取，且特异性地聚集在线粒体膜上和线粒体内，这说明KA@HM-LPS 具有Legumain 酶响应性线粒体靶向特点，其可以被Legumain酶过表达的癌细胞特异性摄取，并靶向至癌细胞的线粒体。结果见图6。

2.9 KA@HM-LPS对肝癌细胞迁移和侵袭的影响

肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤发生、发展、转移和复发的重要原因[27]。本研究通过Transwell 实验分别测定KA@HM-LPS对LGMN+-SK-Hep-1 细胞迁移和侵袭的影响。

2.9.1 细胞迁移实验将LGMN+-SK-Hep-1 细胞重悬于无血清胰酶MEM培养基中，按照1×104个/孔接种至Transwell 小室。将细胞分为空白对照组（加入无血清胰酶MEM培养基）、HM组、未修饰脂质体（HM-LPS）组和KA@HM-LPS组，其中涉及HM的终浓度均为20 μmol/L（剂量依据来源于前期预实验）。下室加入20%胎牛血清600 μL，在5%CO2、37 ℃条件下培养48 h。上室用PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色20min，PBS洗3 次，晾干，拍照[28]。Transwell 實验图片分析应用Image J 1.53 软件，实验数据分析和统计同“2.2.2”项下。结果显示，KA@HM-LPS对LGMN+-SK-Hep-1 细胞迁移的抑制作用显著高于HM-LPS（P<0.001）。结果见图7、图8A。这说明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain酶过表达癌细胞的迁移。

2.9.2 细胞侵袭实验Transwell 上室先用50 μL 基质胶（V 基质胶∶VPBS=1 ∶8）铺胶，4 ℃过夜，再水化。后续实验步骤同“细胞迁移实验”。结果显示，KA@HM-LPS对LGMN+-SK-Hep-1 细胞侵袭的抑制作用显著高于HM-LPS（P<0.001），结果见图8B、图9。这说明KA@HM-LPS 可以更好地抑制Legumain 酶过表达癌细胞的侵袭。

3 讨论

引起肝癌的主要危险因素有乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化等各种慢性肝损伤[29]。由于肝癌早期症状不明显，确诊时通常已扩散到肝实质外[26]。生物碱作为一类天然中药成分，具有抑制肿瘤细胞增殖、转移、血管生成，改变细胞形态，促进细胞凋亡和自噬，触发细胞周期阻滞，调节多种癌相关基因和通路等抗肿瘤作用[30]。HM虽然也具有很好的抗肿瘤作用，但存在毒性问题，故本研究制备了KA@HM-LPS。

本研究首先筛选KA@HM-LPS的制备方法和均质化方法。结果显示，薄膜分散法结合挤出法得到的KA@HM-LPS 呈负电荷，粒径较小，其PDI 在0.3 左右，包封率为（90.50±0.62）%。体外释放率是评价缓控释制剂的重要参数之一，本研究中20%血浆中的体外释放率结果显示，KA@HM-LPS与HM溶液相比具有明显的缓释效果，体外释放曲线更符合Weibull 分布。KA@HM-LPS 在37 ℃、10%胎牛血清中12 h 后的粒径几乎未再变大，表明KA@HM-LPS的血清稳定性良好。

KA@HM-LPS在HM质量浓度为160 μg/mL时的溶血百分数低于游离HM在质量浓度为40 μg/mL 时的溶血百分数，说明KA@HM-LPS在体内具有良好的血液相容性。而且，KA@BLPS 对正常肝细胞LO2 的毒性低，说明载体的生物相容性较好。但是，KA@BLPS具体对机体的安全性还需要在体内模型中分别从血液学和组织学方面进一步评价。另外，本研究还比较了KA@HM-LPS 对LGMN+-SK-Hep-1 和SK-Hep-1 细胞的增殖抑制活性和线粒体靶向性。结果显示，在LGMN+-SK-Hep-1 细胞中，KA@HM-LPS的抑制作用更大，且可以特异性聚集在其线粒体上。Transwell 实验结果显示，KA@HM-LPS对LGMN+-SK-Hep-1 细胞迁移和侵袭的抑制作用均高于HM-LPS。

综上所述，将HM制备成KA@HM-LPS可以有效抑制Legumain酶过表达的肝癌细胞的迁移和侵袭，并提高HM的血液相容性。本研究后续将通过动物实验进一步验证KA@HM-LPS在体内的安全性和靶向性，以探究该载体设计的有效性。