不同鸭坦布苏病毒病疫苗免疫效果的比较

叶伟成，华炯钢，倪征，云涛，陈柳，朱寅初，张存

(浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

鸭坦布苏病毒病是2010年在我国福建、浙江、江苏等地区的蛋种鸭中首次暴发的一种新型传染病，其病原属于黄病科(Flaviviridae)黄病属(Flavivirus)坦布苏病毒(Tembusu virus)的新成员，该病主要表现为产蛋鸭卵巢出血坏死、萎缩、破裂等严重病变，产蛋率一周内可降至10%～30%[1-4]，给养鸭业带来巨大损失。

疫苗免疫接种是控制动物病毒性传染病最为经济有效的措施。近年来，科研工作者对鸭坦布苏病毒病疫苗的研究做了大量的工作，并取得了一定的成效，市面上不仅有不同地方毒株的灭活疫苗，还有采用不同方法致弱的活体疫苗可选[5-7]。然而不同的疫苗免疫后鸭产生抗体的快慢、消长情况等特性是不同的。本试验旨在通过选取有代表性的鸭坦布苏病毒病弱毒疫苗和灭活疫苗对鸭进行免疫，检测抗体消长情况，为制定合理的免疫程序提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1 d龄麻鸭购自杭州萧山汉潮有限公司；产蛋鸭免疫试验在绍兴咸亨绍鸭育种有限公司、德清利虹禽业有限公司和诸暨国伟禽业有限公司3个公司的鸭场进行。鸭坦布苏病毒病灭活苗HB株购自瑞普保定生物药业有限公司，弱毒疫苗WF100株购自齐鲁动物保健品有限公司，灭活疫苗ZJ407株及弱毒疫苗ZJ407-168株由本实验室自制。ELISA试验所需的抗原(E蛋白DⅢ结构域蛋白)包被的酶标板、标准阴性血清、标准阳性血清由本实验室制备，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG二抗购自美国KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 实验室免疫试验

将50只1 d龄麻鸭在本实验室动物房养至7 d龄并分成5组，免疫组每组10只，非免疫对照组10只，隔离饲养。免疫组按说明书上的免疫剂量分别免疫鸭坦布苏病毒病的4种疫苗(HB株、ZJ407株灭活疫苗；WF100株、ZJ407-168株弱毒疫苗)。免疫后3周用相同剂量再免疫一次，免疫后每隔1周采一次血，分离的血清于-20 ℃冰箱保存备用，直至免疫后6周。

1.2.2 养殖场免疫试验

ZJ407-168株弱毒疫苗在绍兴咸亨绍鸭育种有限公司鸭场免疫3月龄麻鸭300只，1羽份/只；WF100株弱毒疫苗在德清利虹禽业有限公司鸭场免疫3月龄麻鸭300只，1羽份/只；HB株、ZJ407株灭活疫苗在诸暨国伟禽业有限公司分别免疫3月龄麻鸭(剂量每只1 mL)每组300只，共2组。各场免疫鸭在免疫后3周用同样的剂量加强免疫一次，免疫后在1、2、3、4、5、6、8周、3个月、6个月时每组随机采30只鸭的血，分离的血清于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 抗体测定

将待检血清样品及标准的阴阳性血清用含10%脱脂奶粉的磷酸缓冲液(PBST)作100倍稀释后，加入经E蛋白DⅢ结构域蛋白包被且用封闭液封闭过的酶标板上，每孔100 μL 37 ℃作用1 h后用PBST洗涤3次，每孔加入PBST作1∶15 000稀释酶标羊抗鸭二抗，每孔100 μL 37 ℃作用1 h后用PBST洗涤3次，加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物液，每孔100 μL避光显色10 min后，加入1 mol·L-1H2SO4(每孔50 μL)终止反应，立即于450 nm波长的酶标仪中测定D值[8-9]。

2 结果与分析

2.1 实验室雏鸭产生抗体的规律及阳性率

雏鸭免疫后采集的血清样品经间接ELISA检测，大于阴性血清D4502倍判定为阳性，并计算出阳性率(表1)。从表1可见弱毒疫苗免疫组产生抗体比灭活疫苗免疫组要快14 d左右，但弱毒疫苗免疫组的抗体阳性率在4周左右就开始下降，而灭活疫苗免疫组产生抗体的阳性率4周后都达到100%。

表1 7 d龄雏鸭免疫不同疫苗后的抗体阳性率

2.2 鸭场免疫灭活疫苗后抗体检测

产前鸭免疫鸭坦布苏病毒病油佐剂灭活疫苗(ZJ407株、HB株)后采集血清样品，经间接ELISA法测定获得各样品的D450值，并根据D450值制成散点图(图1)。从图1可见这两种疫苗免疫后产生抗体的消长情况没有明显差别，免疫后14 d有50%的鸭抗体呈阳性，21 d时可达90%以上，28～180 d产生的抗体都能维持在较高的水平，各鸭之间的抗体滴度比较稳定。

2.3 鸭场免疫弱毒疫苗后抗体检测

从图2中可见，两种弱毒疫苗免疫一周后大部分的鸭能够检测到抗体，两周后抗体阳性率可达100%。免疫后7周的抗体检测情况显示，WF100株免疫后的抗体水平比较平稳，而ZJ407-168株免疫后鸭的抗体呈下降的趋势，这是否与免疫鸭的品种、饲养管理不同有关，有待进一步研究。但在180 d检测周期的每个时间段，免疫鸭产生的抗体都是有高有低，很不一致，说明弱毒苗受免疫鸭个体差异的影响比较大。

3 讨论

本研究选择鸭坦布苏病毒病的灭活疫苗、弱毒疫苗各两种在实验室及鸭场进行免疫试验，结果表明：在实验室、鸭场免疫结果一致，免疫鸭坦布苏病毒弱毒活体疫苗的鸭产生抗体迅速，要比免疫灭活疫苗的鸭产生抗体的时间早14 d左右，弱毒疫苗免疫后7 d就有50%的鸭检测到抗体，14 d时抗体阳性率可达100%；免疫灭活疫苗的鸭14 d时抗体阳性率才达到50%左右，免疫后21 d抗体阳性率为80%～90%，抗体阳性率达100%要免疫后28 d以上。这与吴晓刚等[10]报道的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗(FX2010-180P株)、段会娟等[11-12]报道的鸭坦布苏病毒灭活疫苗(HB株)的免疫试验结果相符。但弱毒疫苗免疫组抗体的持续时间不如灭活疫苗免疫组，弱毒疫苗免疫后3个月时抗体的阳性率就下降到60%～70%；而灭活疫苗免疫组免疫后6个月时抗体的阳性率还能维持在90%以上，且用ELISA检测到的抗体D值都要高于弱毒活体疫苗免疫的鸭。另外，从绘制的散点图中可以直观地看出：灭活疫苗免疫组检测到的抗体D值比较均一，而弱毒疫苗免疫组检测到的抗体D值参差不齐，这与灭活疫苗免疫抗原量大，受鸭个体差异影响小，而弱毒疫苗免疫抗原量少，受免疫鸭个体差异影响大等因素有关。因此，从本研究的结果可知，弱毒疫苗具有产生抗体速度快、免疫抗原量少、不加佐剂副作用小等优点，适合于受鸭坦布苏病毒威胁时紧急免疫或没有母源抗体的雏鸭首次免疫，而灭活疫苗免疫后产生抗体的持续期长，适合于产蛋鸭开产前免疫。