哈茨木霉菌对砂糖橘苗木的促生作用及差异代谢物的分析

杨宝敏, 姜家琳, 杨月华, 李双如, 姜 玲

(华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室,湖北 武汉 430070)

木霉菌(Trichodermaspp.)是一种存在于土壤中的植物病原菌生物防治菌，能够改善植物根系微环境并在根系定殖而辅助根系吸收营养，并且产生的多种抗生次级代谢产物对植物真菌、细菌、病毒等病原微生物有抑制作用，可以诱导植物产生系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)[1-4]。木霉菌还能够通过竞争根系营养和空间、重寄生等抑制或杀灭病原菌[5-6]。哈茨木霉菌(T.harzianum)是木霉属中应用最广的菌株，能促进植株生长和抑制病原菌侵染，其生防效果已在不少农作物中得到验证。哈茨木霉菌能提高黄瓜根系活力，促进根系发育和光合作用，从而促进黄瓜植株生长[7]；哈茨木霉菌、丛枝菌根真菌和荧光假单胞杆菌协同处理可以抑制豌豆根腐病并促进豌豆生长和增产[8]；使用哈茨木霉菌拌土或灌根能促进大白菜生长，抑制根肿病[9]；哈茨木霉菌配施商品有机肥并减施纯氮11%，能有效促进玉米生长发育和光合作用，并能提高土壤速效养分含量和有机质含量，增强土壤肥力[10]；采用哈茨木霉菌LTR-2拌种剂对小麦拌种处理，能够降低根际土壤中链格孢属、赤霉属等病原真菌比例，降低病害发生的几率[11]；哈茨木霉菌LTR-2活体孢子可湿性粉剂(木霉菌肥效剂)拌种处理冬小麦，能显著提高出苗数，增产4.83%[12]。

代谢组学是对在特定生理时期内某一生物或细胞所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。细胞代谢活动是植物生命活动的基础，细胞内代谢物质水平与细胞内生命活动息息相关，通过代谢物分析可以阐明植物对外源性物质刺激所做出的所有代谢应答[13-15]。Vinale et al[16]发现哈茨木霉菌次生代谢产物中的蒽酮类物质6PP(6-n-pentyl-6H-pyran-2-one)不仅可以抑制病原菌生长，还能促进番茄、油菜的生长。

柑橘是重要的大宗水果之一，苗木质量直接影响柑橘产业的可持续发展。王男麒等[17]报道了哈茨木霉菌对柑橘果实采后防腐保鲜的作用。目前尚未见哈茨木霉菌对柑橘苗木质量影响的相关报道。本研究通过对砂糖橘苗木进行哈茨木霉菌灌根处理，了解哈茨木霉菌对其生长的影响，并比较了哈茨木霉菌引起的砂糖橘苗木代谢物的变化，以期为哈茨木霉菌在柑橘苗木繁育中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 哈茨木霉菌灌根处理

以枳砧嫁接的砂糖橘苗木为试材，种植于高25 cm、直径23 cm塑料盆中，基质的泥炭、蛭石和菜园土各占1/3，水、肥管理条件一致。哈茨木霉菌由山东绿陇生物科技有限公司生产,有效活菌数>0.1×109个·g-1。本研究设A、B两个处理，即将哈茨木霉菌粉状菌剂溶于1.5 L水，对每株苗木进行灌根处理,以探究不同质量浓度哈茨木霉菌水溶液对砂糖橘苗木生长的影响。A处理为：1.33 g·L-1灌根8次+2.00 g·L-1灌根7次；B处理为：3.33 g·L-1灌根8次+4.00 g·L-1灌根7次。即从2020年9月4日起，每隔6 d对每株苗木灌根1次，A、B处理哈茨木霉菌水溶液质量浓度分别为：1.33、3.33 g·L-1，共灌根8次；由于前期8次剂量小，为了增大哈茨木霉菌处理后苗木的反应，从2021年3月5日起的第9～第15次灌根，A、B处理哈茨木霉菌水溶液浓度分别提高为：2.00、4.00 g·L-1；对照(CK)浇灌等量的清水。处理组和CK各种植6盆砂糖橘苗。

1.2 矿物元素测定

当哈茨木霉菌水溶液灌根8次时，处理组和CK表型差异已比较明显，采集砂糖橘苗叶样，参考周高峰[18]方法测定叶片矿物元素含量。叶片用去离子水清洗后，放入110 ℃烘箱中杀青30 min，然后将叶片磨成粉状。称取0.100 0 g叶片粉末，在马弗炉中550 ℃下灰化处理5 h，降至室温后加入3 mL HCl、1 mL HNO3，用水定容至10 mL。提取30 min，过滤，将滤液稀释3倍，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，安捷伦公司)检测大量元素(P、K、Ca、Mg、S)和微量元素(Fe、Mn、Cu、Zn、Na、Al)共计11种矿物元素含量。将砂糖橘苗叶样在90 ℃下烘干，过100目筛网，采用元素分析仪(Elementar公司)检测全氮含量。

1.3 苗木形态和生理指标测定

当哈茨木霉菌水溶液灌根15次时，比较A、B处理和CK的株高、干径、叶面积和根系。在离盆中土面10 cm处测量干径；叶面积/cm2=成熟叶片平均叶面积×叶片数；叶绿素含量测定参考王学奎[19]的方法并稍做修改，同时检测叶片的叶绿素相对含量(SPAD值)。试验数据采用SPSS Statistics 22.0软件进行单因素同质性分析及差异显著性分析。

1.4 非靶向代谢物检测

1.4.1 叶片中代谢物提取 在哈茨木霉菌水溶液第8次灌根24 h后，采集部位和成熟度相对一致的叶片，设置6个生物学重复。(1)称取100 mg叶片放入液氮中研磨成粉，将研磨后的叶片组织全部转移于1.5 mL离心管中，加入500 μL体积分数为80%甲醇水溶液，涡旋震荡后冰浴静置5 min。(2)12 000 r·min-1、4 ℃下离心20 min后，吸取250 μL上清液于1.5 mL离心管中，加入127.4 μL质谱级水将上清液稀释至甲醇含量为53%。(3)再次在12 000 r·min-1、4 ℃下离心20 min，收集上清液，样品用LC-MS进行分析，并从每个试验样本中选取等体积样本混匀作为QC样本。(4)色谱仪Vanquish UHPLC(Thermo Fisher)上设置色谱柱为Hypesil gold column(C18)，柱温40 ℃，流速0.2 mL·min-1。正模式：流动相A是0.1%甲酸，流动相B是甲醇；负模式：流动相A是5 mmol·L-1醋酸铵(pH=9.0)，流动相B是甲醇。(5)色谱梯度洗脱程序为：A相98%，B相2%，0～1.5 min；B相100%，12～14 min；A相98%，B相2%，14.1～17 min。(6)将质谱仪QExactiveTM HF-X的质谱扫描范围设定在100～1 500 m·z-1[20]。

1.4.2 偏最小二乘法判别分析质量评估 运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，对样品类别进行预测。经7次循环交互验证，当样本生物学重复数(n)≤3时，为k次循环交互验证，则k=2n，得到模型评价参数(R2,Q2)。如果R2和Q2越接近1，表明模型越稳定、可靠。

1.4.3 代谢物的鉴定 将数据文件导入CD软件中，进行保留时间、质荷比等参数的筛选，然后对不同样品根据保留时间偏差0.2 min和质量偏差5 mg·L-1进行峰对齐，对峰面积进行定量，再整合目标离子。通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测，并与mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist数据库进行比对，用空白样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到定量结果，对阳离子和阴离子结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 哈茨木霉菌对砂糖橘苗木生长的影响

哈茨木霉菌水溶液灌根15次后，各处理砂糖橘苗木形态见图1。对比图1中a与b、c与d、e与f可知，哈茨木霉菌处理过的砂糖橘苗木较未处理前，新根数量多且叶片繁茂，生长旺盛。从图1中g、h、i可知，灌根处理15次后，A处理砂糖橘苗木的新根量多于CK，也多于B处理。

A.A处理灌根前;b.A处理灌根15次；c.B处理灌根前;d.B处理灌根15次；e.未浇灌清水的CK;f.浇灌15次清水的CK；g、h、i分别为灌根15次后A处理、B处理和CK的放大根系。

哈茨木霉菌水溶液灌根15次后，各处理砂糖橘苗木的形态指标对比见表1。由表1可知，A处理苗木叶面积显著大于B处理和CK(图1 b、1d、1f)；B处理苗木的干径增长值显著高于CK；A处理和B处理根系繁茂，根冠截面积均显著高于CK；B处理的叶绿素a含量显著高于CK；A处理和B 处理的叶绿素b含量均显著高于CK；A处理的SPAD值显著高于CK。

表1 哈茨木霉菌灌根后砂糖橘苗木的形态比较1)Table 1 Morphological comparison of citrus nursery plants irrigated with T.harziana

2.2 哈茨木霉菌对砂糖橘苗木叶片矿物元素含量的影响

矿物元素测定(图2)表明，A处理叶片的P、Ca、Mg、Fe、Zn含量均显著高于CK(P<0.05)；B处理叶片的P、Ca、Mg、Zn含量均显著高于CK(P<0.05)；但哈茨木霉菌处理和CK的全氮含量差异不显著。

图2 哈茨木霉菌处理对砂糖橘苗木叶片矿物元素含量的影响Figure 2 Effect of T.harziensis on mineral nutrients contents of citrus leaves

2.3 差异代谢物的筛选

2.3.1 差异代谢物的偏最小二乘法判别分析 采用偏最小二乘法(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)建立了代谢物表达量与样品类别之间的关系模型(图3)，以分析非靶向代谢组数据。R2Y表示模型的解释率，Q2Y用于评价PLS-DA模型的预测能力。当R2Y>Q2Y时，表示建立的模型良好。由图3可知，A处理与CK、B处理与CK、A处理与B处理阳离子和阴离子分析均满足上述条件，3个组均建立了良好的模型。

A.LA vs CK (阴离子);b.LA vs CK(阳离子);c.LB vs CK(阴离子);d.LB vs CK(阳离子);e.LB vs LA(阴离子);f.LB vs LA(阳离子)。

2.3.2 差异代谢物筛选结果 利用阴阳离子分析，筛选出各处理与CK的差异代谢物。其中，阳离子检测共获得1 048种代谢物，与CK相比，A处理有8种代谢物上调和12种代谢物下调，B处理有32种代谢物上调和16种代谢物下调；B处理与A处理相比，有15种代谢物上调和7种代谢物下调。阴离子检测共获得748种代谢物，与CK相比，A处理有6种代谢物上调和12种代谢物下调，B处理有13种代谢物上调和24种代谢物下调；B处理与A处理相比，有8种代谢物上调和8种代谢物下调(表2)。

表2 差异代谢物筛选结果Table 2 Metabolite differential screening results

2.4 差异代谢物火山图

火山图可直观表现处理与CK差异代谢物的分布情况。火山图中每个点代表1个代谢物，显著上调、下调的代谢物分别用红色圆点、绿色圆点表示，圆点的大小代表VIP值(图4)。A处理及CK经阳离子、阴离子分析后，上调和下调的重要代谢物见表3。从表3可见，这些代谢物包含2种氨基酸衍生物和1种氨基酸类化合物、2种羟基酸及其衍生物、2种羧酸及其衍生物、3种脂肪酸、3种类黄酮、3种内酯、2种有机含氮化合物、2种孕烯醇酮脂类。此外，还包括糖苷类、腺苷类、有机氧化合物、苯及其衍生物、糖醇类、环烯醚萜苷、烯胺、脂肪酸衍生物、嘧啶核苷酸、二糖、大环内酯类和类似物、生物素各1种以及6种其他物质。

A.LA vs CK (阴离子);b.LA vs CK(阳离子);c.LB vs CK(阴离子);d.LB vs CK(阳离子);e.LB vs LA(阴离子);f.LB vs LA(阳离子)。

表3 哈茨木霉菌A处理与CK的重要差异代谢物Table 3 Important differential metabolites between T.harziana A treatment and control

2.5 差异代谢物KEGG富集闪点图分析

在LA vs CK_KEGG路径(阴离子)富集闪点图中，KEGG注释到141个背景代谢物，有4条KEGG路径被富集(P<0.05)，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解、丙酸盐代谢、花青素生物合成和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，它们分别涉及的代谢物是甲基丙二酸、甲基丙二酸、山慈菇花甙和L-O-磷酸丝氨酸(图5a)。在LA vs CK_KEGG路径(阳离子)富集闪点图中，KEGG注释到146个背景代谢物，有3条KEGG路径被富集(P<0.05)，包括鞘脂代谢、碳青霉烯生物合成和生物素代谢，它们分别涉及的代谢物是4-羟二氢鞘氨醇、泛硫醇和生物素代谢(图5b)。在LB vs CK_KEGG路径(阴离子)富集闪点图中，KEGG注释到141个背景代谢物，有3条KEGG路径被富集(P<0.05)，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解、丙酸代谢和花青素合成，它们分别涉及的代谢物是甲基丙二酸和山慈菇花甙(图5c)。在LB vs CK_KEGG路径(阳离子)富集闪点图中，KEGG注释到146个背景代谢物，有2条KEGG路径被富集(P<0.05)，包括氨基酸生物合成和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢。两条路径分别涉及的代谢物是高丝氨酸、4-磷酸赤藓糖、高丝氨酸和苏氨酸(图5d)。

A.LA vs CK_KEGG(阴离子)；b.LA vs CK_KEGG(阳离子)；c.LB vs CK_KEGG(阴离子)；d.LB vs CK_KEGG(阳离子)。

3 讨论

3.1 哈茨木霉菌处理显著促进5种矿物元素的吸收

本研究表明,适量的哈茨木霉菌A处理(1.33 g·L-1灌根8次+2.00 g·L-1灌根7次)能显著促进砂糖橘苗木地上部分和地下部分的生长，使叶面积增大、新根更繁茂，这与前人研究认为哈茨木霉菌具有促生作用相似[7-8]。哈茨木霉菌处理后，砂糖橘叶片矿物元素含量由高到低依次为：Ca>K>Mg>P>S>Na>Al>Fe>Mn>Zn>Cu>Zn，这和前人研究相似[21]。A处理叶片的P、Ca、Mg、Zn和Fe含量显著提升(P<0.05)，B处理叶片的P、Ca、Mg、Zn含量显著提升(P<0.05)。B处理哈茨木霉菌的菌剂量比A处理稍高，推测这可能与细菌自身也会消耗和调节Fe元素利用有关[22-23]。P元素能促进早期根系的形成和生长，提高植物适应环境的能力，增强抗病性[24]；Ca元素是细胞壁重要成分，能稳定生物膜结构，促进根系生长、增加水分吸收，还参与信息传递，激活态的钙调素可以激活多种关键酶，使细胞产生与信号相对应的生理反应[25]；Mg不仅是叶绿素的构成元素，也是许多酶的活化剂[26]；Zn可以提高植物抗逆性；Fe参与植物体内氧化还原反应和电子传递，是叶绿素合成所必需的微量元素[27]。由此可见，哈茨木霉菌可能通过促进上述元素的吸收，达到促生和提高抗性的目的。

3.2 哈茨木霉菌处理对几条重要代谢路径的加强

在被富集到的KEGG上调路径中，哈茨木霉菌处理加强了缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解，促进12～16大环内酯成员的生物合成以及多聚肽骨架的生物合成，为杀菌化合物的合成奠定了基础[28]。本试验还发现，哈茨木霉菌处理后，丙酸代谢路径显著上调，其中代谢物甲基丙二酸作为底物可用于有机合成，涉及酯化反应，与甲脒反应合成嘧啶甜菜碱类物质和合成丙二酸半硫酯(malonic acid half thioesters, MAHT)。哈茨木霉菌处理加强了花青素合成，直接促进山慈菇花甙合成[29]。山慈菇花甙属于聚酮化合物，是抗生素物质的骨架。哈茨木霉菌处理还能促进氨基酸代谢。氨基酸起到氮的平衡作用，氨基酸分解代谢可以转变为糖或脂肪，或进入三羧循环氧化分解成CO2和水，并释放能量。

哈茨木霉菌处理还促进了鞘脂代谢、碳青霉烯生物合成和生物素代谢。鞘脂是生物膜结构的重要组成成分，鞘脂及其代谢产物参与调节细胞的生长、分化、衰老和细胞程序性死亡等信号转导过程。鞘脂在植物中通过植物神经酰胺对纤维细胞伸长具有重要作用[30]。碳青霉烯是β-内酰胺抗生素，具有广谱、耐酶等特点，有利于提高植物的抗病能力[31]。生物素对基因表达的调控起着重要的作用。

综上所述，本研究通过非靶向代谢物质谱分析，获得了哈茨木霉菌处理激发砂糖橘苗木差异代谢物的信息，证明了哈茨木霉菌处理可以促进砂糖橘苗木矿物营养吸收，加强氨基酸代谢与多种重要代谢物的富集，有利于叶面积增大和根系发达，从而促进了植株生长。同时，重要次生代谢物的积累可能是提高植株免疫力和抗病性的物质基础。