蝴蝶兰“火凤凰”组织培养关键技术研究

曾燕红，玉新爱，苏荣军

（1.广西玉林农业学校，广西 玉林 537000；2.玉林市农业科学院，广西 玉林 537000）

蝴蝶兰属兰科蝴蝶兰属。花体轻盈美丽，花形奇特，花色艳丽，花期长，被称为“洋兰皇后”（图1）。由于其观赏和经济价值高，深受国内外花卉市场的青睐。蝴蝶兰属单茎气生兰，极少数侧枝。所以，在大规模生产中，采用分株繁殖是非常困难的。此外，由于大部分的种子尚未完全成熟，而且种子中没有胚乳，因此发芽速度较慢，难以通过播种技术进行有性生殖。组织培养技术具有快速的生长速度和较高的繁殖能力；具有年生产能力高的优点，是目前工厂式育苗的主要技术途径。目前，国内外关于蝴蝶兰的组培技术已较为成熟，但由于品种之间的诱导率差异大、增殖系数低、植物生长调节剂的种类和浓度比例不确定等原因，其技术水平也有差异。所以，开发适合于特殊品种的组培快繁技术系统具有十分重要的现实意义。因此，本文选择了蝴蝶兰“火凤凰”的茎秆作为实验材料，通过对蝴蝶兰“火凤凰”的不定芽诱导、增殖和生根等各个阶段的影响进行了研究，确定了“火凤凰”组培快繁的最佳培养条件，使其快速繁殖技术系统得到优化，为其工业化、规模化生产提供技术支撑[1]。

图1 蝴蝶兰

1 材料和方法

1.1 试验材料

加入不同比例的植物生长调节剂。用8.00 g/L的琼脂对所有的载体进行了固化，并且在25 g/L的蔗糖和5.6的 pH值下进行了固化。加入0.50 g/L的活性碳（AC）以防爆炸褐化，然后在121℃下进行30 min的杀菌，如图2所示。

图2 蝴蝶兰组织培养（一）

1.2 材料选择和灭菌

开花期间，从花卉市场购买蝴蝶兰“火凤凰”，应选择生长旺盛、无病虫害、无变异的母株为外植体。在收集前对外植体进行预处理（在收获前5～7 d向母株喷洒菌剂），能有效地预防和降低内源污染，增加诱变成功率。外植体的最佳选择是蝴蝶兰第一芽开花的带腋芽花梗。将其切成5 cm左右的小段，小镊子去除腋芽外部苞片，放入烧杯中，如图3所示。

图3 蝴蝶兰组织培养（二）

在烧杯中滴入几滴洗涤剂，用自来水冲洗6～8 h，再用无菌水冲洗，然后在无菌工作台上消毒表面。表面用75% 酒精消毒30 s，用无菌水冲洗3次，然后用0.1% HgCl2溶液浸泡花梗10 min，继续摇动，用无菌水清洗4～5次；用消毒过的滤纸将物料表面的湿气吹干，然后进行接种。无菌材料是蝴蝶兰组织培养的一个重要条件和保障，而灭菌是一种行之有效的方法。采用表面消毒方法，将表面的细菌杀死，使其在最大程度上维持其活性。所以，在蝴蝶兰的组织培养中，杀菌是一个非常关键的环节（注：消毒时间取决于外植体的种类或成熟度）。

1.3 方法

首先是对疫苗室和操作台进行清洁和消毒，然后是酒精灯；消毒器、接种刀、镊子等接种器具的准备；随后完成接种。

将蝴蝶兰的花梗两端切去，将带腋芽的花梗节切成1～2 cm的小段，根据生长极性插入培养基中。每个处理接种30个外植体，重复3次。注意严格规范无菌操作，尽可能减少因操作不当而引起的污染；严格消毒器具，减少与病毒的交叉感染；切取外植体时要用锐利的刀具和快速的切割，同时要避免互相挤压，以免损伤材料；所有的外植体取刀时，刀口的尺寸和切点都要合理、正确（例如：切花梗的下端为45°切口，上端为平面）；为了确保所需的养分和光照，外植体应在培养皿中均匀地分布。

以MS+花宝1号+花宝2号为基质，添加不同比例的6-BA和NAA。各培养基上分别接种带有腋芽的蝴蝶兰花梗小段，每处理均为20个花梗段，重复3次，30 d后统计各处理诱导率。

采用MS+花宝1号作为基质，添加了6-BA、NAA等不同比例的植物生长调节剂。将初代培养30 d左右的蝴蝶兰不定芽转入增殖培养基中。每次处理20个不定芽，重复3次，培养30 d左右时，统计新的不定芽的发生情况，计算增殖系数。

以1/2 MS、MS为基质，添加不同比例的植物生长调节剂IBA和NAA。选择发育均匀的蝴蝶兰，将其接种于不同的发芽基中进行生根实验。每次处理20株，3次重复，约45 d后统计各处理出根情况。

适宜的温度为25～28℃，环境湿度为60% ～80% 。在黑暗中培育7～9 d，防止褐变，光照强度为2 000～2 500 Lx，光照时间为每天11～13 h。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对腋芽萌发诱导的影响

将消毒后的“火凤凰”花梗接种到不定芽诱导培养基上，14 d左右开始萌发不定芽。添加不同的植物生长调节剂配比，虽然对“火凤凰”花梗诱导率不同，但添加一定浓度的6-BA和NAA都有利于“火凤凰”不定芽的诱导。在9组处理中，处理5的诱导率最高，达到86.7% ，即最佳的不定芽诱导培养基为MS+花宝1号+花宝2号+3.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培养基。

诱导率=萌发的外植体数/接种的总外植体数×100% 。

2.2 不同培养基对不定芽增殖的影响

将不定芽从花梗中分离出来，在15 d后，不定芽基部开始生长出原球茎，25 d左右逐渐长出叶片。当植物生长调节剂NAA浓度相同时，蝴蝶兰“火凤凰”的不定芽增殖系数随着6-BA的浓度升高而升高。但增殖系数大时，叶片颜色淡、生长玻璃化、脆嫩。综合增殖系数和幼苗长势，增殖培养基最优的组合是处理6：MS+花宝1号+5.00 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，增殖系数达到3.9。

增殖系数=增殖不定芽总数/增殖不定芽外植体数。

2.3 不同生根培养基对幼苗生根的影响

在引种蝴蝶兰的基本培养基中，1/2 MS培养基的生根率均高于 MS，而1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA的9号培养基，其生根率达86.7% 。结果表明，最适宜的培养基是1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。

3 结论与讨论

蝴蝶兰的组织培养是影响组织培养成败的重要因素。不同品种的蝴蝶兰，不同的栽培材料，不同的生长时期，不同的栽培材料对培养基的需求也不同。因此，对蝴蝶兰的培养基进行筛选，既是蝴蝶兰组织培养的基础，又是其重要的一步。

在诱导蝴蝶兰“火凤凰”花梗腋芽萌发的实验中，添加一定浓度的6-BA和NAA都有利于“火凤凰”不定芽的诱导，这和高壮壮等[2]的试验结果一致。本试验中最佳的不定芽诱导培养基为MS+花宝1号+花宝2号+3.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培养基。

细胞分裂素对蝴蝶兰不定芽增殖的试验中，6-BA对增殖效果的影响强于 NAA；且浓度5.00 mg/L 6-BA比浓度3.00 mg/L 6-BA的增殖效果要更优。当6-BA浓度为5.00 mg/L时，NAA浓度为1.0 mg/L时的增殖系数比0.50 mg/L增殖效果更高，但幼苗长势受到影响。所以MS作为不定芽增殖的基本培养基，在不同植物生长调节剂浓度配比下，5.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA最适合不定芽增殖生长。这个试验结果与陈春等[3-6]的试验结论相似，表明蝴蝶兰增殖时要同时增殖系数和幼苗生长状态。

而在诱导蝴蝶兰生根的基础培养基中，1/2 MS培养基的生根率总体优于MS培养基，其中生根率最高的是1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA的9号培养基，其生根率为86.7% 。由此可知，诱导蝴蝶兰生根的最适培养基配方为1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA。